血小板微泡對內皮細胞作用及機制的體外研究.pdf

1、微泡是細胞間信號傳導的一種載體，包含蛋白質、mRNA、miRNAs等多種生物活性物質，在細胞的增殖、凋亡、遷移等病理生理過程中扮演重要角色。血小板是循環(huán)中微泡的主要來源，臨床研究顯示在冠心病、房顫等患者的循環(huán)中，微泡含量顯著增加，并且和多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。我們前期的研究顯示，凝血酶激活血小板后產生的微泡中miRNAs的表達譜顯著改變，并且可以被內皮細胞吸收，在轉錄后途徑發(fā)揮作用。MiRNA是一種長度約為21-23個核苷酸的

2、非編碼單鏈RNA分子，通過特異性結合mRNA序列，誘導轉化或者降解mRNA，調控基因的表達。隨著研究的進展，miRNA在各種病理生理過程中的調節(jié)作用越來越受到重視，并有可能成為疾病診斷的標志物和未來生物治療的靶點。
　　研究目的:
　　(1)建立完善血小板來源微泡(PMP)的分離、提取及鑒定方法，并比較漩渦震蕩和凝血酶兩種刺激方式對微泡及其表面膜蛋白的影響;(2)研究凝血酶刺激產生的血小板微泡對內皮細胞凋亡、遷移、活性氧(R

3、OS)產生、一氧化氮(NO)及炎癥因子分泌的作用;(3)初步探索微泡對內皮細胞中miRNAs表達的影響，及其中的miRNA對內皮細胞上述表型的作用及機制。
　　研究方法:
　　(1)使用凝血酶刺激和漩渦震蕩刺激血小板產生微泡，使用梯度離心法收集血小板來源的微泡，利用流式細胞儀分析微泡的大小、數(shù)量及表面的膜蛋白，透射電鏡分析微泡的內在結構。(2)應用H2O2誘導臍靜脈內皮細胞凋亡，應用AnnexinⅤ-FITC/PI雙染檢測凝

4、血酶刺激所得微泡對內皮細胞凋亡的影響;平板劃痕和Transwell評價微泡對內皮細胞遷移能力的影響;Elisa法確定微泡對內皮細胞分泌炎癥因子的影響;Griess法測定微泡對內皮細胞分泌NO的影響;ROS試劑盒結合Image J軟件檢測微泡對內皮細胞ROS產生的作用。(3)實時定量PCR測定微泡對內皮細胞microRNAs表達譜的改變作用。挑選其中改變最明顯的microRNA進行轉染，并測定其對內皮細胞上述各種表型的影響。應用雙熒光素酶

5、報告基因驗證可能相對應的靶基因。
　　研究結果:
　　(1)流式細胞儀鑒定顯示，阿司匹林可以有效抑制血小板微泡的產生，凝血酶和漩渦震蕩刺激血小板均可產生大量微泡。通過凝血酶刺激和漩渦震蕩刺激并用梯度離心法可以提取純度較高的血小板微泡。微泡膜表面的具有復雜的蛋白成分，表達多種來源于血小板的膜蛋白。漩渦震蕩和凝血酶刺激獲得的微泡表面CD63表達差異明顯（55.38±5.27％vs43.50±3.86％，p＜0.05）。透射電鏡顯

6、示微泡內部結構復雜多樣，電子密度不一，包含α顆粒、糖原顆粒、線粒體等復雜成分。(2)凝血酶刺激所得血小板微泡可以促進氧化應激誘導的內皮細胞凋亡（25.59±9.50％vs12.42±1.23％，p＜0.05）、細胞內ROS的產生(0.140±0.010/pixelvs0.109±0.010/pixel，p＜0.05)及IL-1β的分泌（2.67±0.87pg/ml vs1.25±0.41pg/ml，p＜0.05），抑制其遷移（平板劃痕:

7、47.99±4.65％vs61.68±2.80％，p＜0.05;Transwell:123±15vs206±14，p＜0.01）和NO的分泌(27.68±1.70mmol/L vs34.13±1.47mmol/L，p＜0.01)。(3)微泡處理內皮細胞后，細胞內miR-223(150.60±29.63vs1.00±0.75，p＜0.001)、miR-320（20.84±18.58vs1.07±0.98，p＜0.05）顯著升高。腺病毒轉染

8、miR-223后促進了氧化應激誘導的內皮細胞凋亡(22.45±2.34％vs12.95±0.36％，p＜0.001)、抑制了其遷移（平板劃痕:66.66±4.21％vs71.59±4.02％，p＜0.05;Transwell:151±17vs215±29，p＜0.05），但對細胞內ROS的產生、炎癥因子及NO的分泌無明顯影響。Targetscan軟件及文獻回顧預測NRF1、ATP7A、ZEB1三種miR-223的靶基因。在mRNA水平上

9、，miR-223對內皮細胞中NRF1、ATP7A、ZEB1的表達并無顯著作用。雙熒光素酶報告基因顯示，miR-223對NRF13'UTR串聯(lián)的報告基因活性無明顯抑制，結合位點突變后報告基因活性無明顯增強。
　　研究結論：
　　(1)血小板極易激活并產生大量表達血小板表面膜蛋白成分、大小結構不一、內容物復雜的微泡;通過梯度離心法可以提取純度較高的血小板微泡;凝血酶刺激所得微泡表面CD63較漩渦震蕩刺激所得微泡表面明顯降低。(2