內(nèi)皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)及洛克沙胂對內(nèi)皮細(xì)胞影響的初步研究.pdf

1、洛克沙胂是國內(nèi)外廣泛使用的一種有機(jī)胂飼料添加劑，近來的研究表明其能促進(jìn)入血管內(nèi)皮細(xì)胞生長，存在著促血管生成作用及潛在的致癌風(fēng)險。有關(guān)洛克沙胂促血管內(nèi)皮細(xì)胞生成作用的研究極少，國內(nèi)未見報道。本研究進(jìn)行了大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定，并利用MTT法檢測細(xì)胞活力、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期、劃痕實驗檢測細(xì)胞的遷移能力，初步探討洛克沙胂對血管內(nèi)皮細(xì)胞生長的影響。
　　采用大鼠主動脈植塊法和Ⅰ型膠原蛋白酶酶消化法分離大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞;采

2、用差速消化法去除內(nèi)皮細(xì)胞中的雜細(xì)胞，通過DMEM培養(yǎng)基中加入VEGF和肝素鈉進(jìn)行條件培養(yǎng)，并進(jìn)行了傳代培養(yǎng)和生長曲線的繪制;通過外觀形態(tài)、電鏡分析以及免疫組化方法對分離培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行了鑒定。分離培養(yǎng)的細(xì)胞呈多角形、“鋪路石”狀;透射電鏡下觀察可見分離培養(yǎng)的細(xì)胞具有內(nèi)皮細(xì)胞特征的W-P小體;CD31 SABC免疫組化及免疫熒光分析均呈陽性。
　　內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)不同處理培養(yǎng)6h后用MTT法檢測細(xì)胞活力。各組洛克沙胂的濃度分別為10.00μ

3、M、1.00μM、0.10μM、0.01μM，5ng/mL VEGF為陽性對照，PBS為陰性對照。試驗結(jié)果顯示洛克沙胂及VEGF陽性對照組OD值與陰性對照組相比差異顯著（P＜0.05）;洛克沙胂在0.01μM～1.00μM范圍內(nèi)，隨著劑量增加OD值隨之增加，呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。1.00μM洛克沙胂組與5 ng/mL VEGF組的OD值相當(dāng);但10.00μM洛克沙胂組與1.00μM洛克沙胂組的OD值相比沒有增加反而減少，與0.01μM

4、洛克沙胂組相當(dāng)。證明洛克沙胂較低劑量對血管內(nèi)皮細(xì)胞生長有明顯的促進(jìn)作用，而較高劑量(10.00μM)促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長的作用減弱。
　　內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)不同處理，培養(yǎng)6h后用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期。洛克沙胂濃度分別為10.00μM、1.00μM、0.10μM，5 ng/mL VEGF為陽性對照，PBS為陰性對照。0.1μM、1.0μM洛克沙胂組以及VEGF對照組S期細(xì)胞數(shù)量明顯高于PBS對照組;G2期細(xì)胞數(shù)量低于PBS對照組;而G1期無

5、顯著性差異。結(jié)果表明0.1μM、1.0μM洛克沙胂具有明顯的促內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用。
　　劃痕實驗中洛克沙胂濃度分別為10.00μM、1.00μM、0.10μM，5 ng/mL VEGF為陽性對照，PBS為陰性對照。劃痕后，內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)洛克沙胂處理12h后鏡下拍照。結(jié)果表明洛克沙胂0.01μM～1.00μM范圍內(nèi)，隨劑量增加促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移作用加強(qiáng)，1.00μM時促遷移能力最強(qiáng)，10.00μM時促進(jìn)作用反而減弱。
　　綜上所述，