Tim-4在調(diào)控Kupffer細胞免疫功能及誘導肝移植術后免疫耐受中的機制研究.pdf

1、背景：肝移植是目前治療各種終末期肝病的最佳治療手段。而移植術后急、慢性排斥反應、缺血再灌注損傷，與肝臟供體缺乏一起，成為了肝移植領域面臨的主要挑戰(zhàn)。誘導肝移植術后免疫耐受是避免移植肝臟失功及長期服用免疫抑制劑的最佳途徑，也是近年移植領域研究的重點和熱點。Kupffer細胞（KCs）作為肝臟的最大巨噬細胞群，在肝移植免疫中發(fā)揮著極其重要的作用，其機制與抗原提呈、不同表型下的免疫功能及調(diào)控T淋巴細胞免疫功能等密切相關。新近研究發(fā)現(xiàn)，T細胞免

2、疫球蛋白粘蛋白4(Tcell immunoglobulin domain and mucin domain,Tim-4)參與了Th2細胞分化、凋亡細胞吞噬清除、巨噬細胞功能調(diào)節(jié)等諸多免疫調(diào)控的重要環(huán)節(jié)。但目前為止有關Tim-4分子的研究主要集中在變態(tài)反應性疾病及自身免疫性疾病方面，尚未涉及肝移植免疫。因此，探索Tim-4對KCs免疫功能及在肝移植術后免疫調(diào)控中的作用及機制，可能為誘導肝移植術后免疫耐受提供新的思路和理論依據(jù)。
　　

3、第一部分、Tim-4表達變化對Kupffer細胞免疫功能調(diào)控的作用研究
　　目的：通過抑制或上調(diào)KCs中Tim-4表達，觀察Tim-4過表達及沉默狀態(tài)下對KCs分泌Th1/Th2類細胞因子及抗原呈遞作用的影響及相關機制。
　　方法：①非連續(xù)梯度離心法分離、培養(yǎng)BALB/c小鼠肝臟KCs，免疫熒光染色及臺盼藍染色判斷細胞純度及活率，吞墨實驗判斷其吞噬功能；②流式細胞儀及免疫組化檢測KCs特異性表面分子CD163和CD68的表達

4、來鑒定KCs；③鑒定后的KCs隨機分為四組：Tim-4過表達組（AdV-Tim4 group）；過表達對照組（Ctrl-AdV group）；Tim-4抑制組（Tim-4 shRNA group）；抑制對照組(Ctrl-shRNA group)；分別轉染 Tim-4過表達、抑制及相應錯義序列慢病毒獲得穩(wěn)定封閉的細胞群。以LPS（終濃度100ng/mL）活化KCs后作KCs免疫功能相關檢測；④免疫熒光及共聚焦顯微鏡檢測評估Tim-4相關慢

5、病毒轉染效率；⑤ ELISA檢測細胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-10、TGF-β表達水平；⑥ Western Blot及RT-PCR檢測各組KCs中Tim-4、TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-10、TGF-β蛋白和基因表達水平；⑦流式細胞術（FCM）檢測各組KCs的表型分子表達情況；⑧分離BALB/c小鼠脾細胞懸液，制備純化T細胞，F(xiàn)CM檢測純度，與上述各組KCs共培養(yǎng)，MTT法檢測T細胞增殖情況；Ann

6、exin V/PI法觀察T淋巴細胞凋亡情況；⑩ELISA檢測T細胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-10、TGF-β等細胞因子含量；?Western-blot測定KCs中LPS/TLR4/NF-κB及MAPK通路關鍵蛋白p65、p38、ERK1/2、JNK、IRF3及其磷酸化蛋白表達水平。
　　結果：①KCs細胞表面特異性分子表達呈陽性，臺盼藍染色提示KCs活力＞90%，吞墨實驗證實其具有良好的吞噬能力；②轉染Ti

7、m-4慢病毒后，6h開始KCs即出現(xiàn)熒光表達，48h前后達到高峰；Western Blot檢測結果顯示: AdV-Tim4組中 Tim-4蛋白水平顯著高于對照組(1.90±0.41 vs.1.13±0.32, P＜0.05)；而Tim-4 shRNA組中Tim-4的蛋白表達水平與其對照組相比較顯著降低(0.52±0.11 vs.1.3±0.31,P＜0.05)；③ FCM檢測活化的KCs表面共刺激發(fā)現(xiàn)：AdV-Tim4中MHC-II、C

8、D80、CD86、CD40的表達明顯低于對照組，而M2型分子CD204和CD206的表達則高于對照組；而在Tim-4 shRNA組中，以上分子的表達則呈相反趨勢；④ELISA檢測各組KCs培養(yǎng)液中細胞因子發(fā)現(xiàn)：在AdV-Tim4組，TNF-α、IL-1β、IFN-γ的表達與其對照組比較明顯降低（P＜0.05），而IL-10、TGF-β水平較對照組表達增高；在Tim-4抑制組，TNF-α、IL-1β、IFN-γ的表達較其對照組增高，而 I

9、L-10、TGF-β的表達量則呈相反趨勢（P＜0.05）；同時，Western Blot證實KCs中上述細胞因子的蛋白水平變化與ELISA結果一致。⑤Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)：AdV-Tim4組中KCs內(nèi)Ikkα,IκBα,NF-κB p65，ERKl/2、p38和IRF3的蛋白表達及其磷酸化水平均受到抑制，JNK蛋白表達無顯著變化；而在Tim-4 shRNA中，上述蛋白的磷酸化表達有所增強；⑤T細胞與各組KCs共培養(yǎng)72h后，

10、MTT結果表明：AdV-Tim4組T淋巴細胞的增殖較對照組受到抑制（0.43±0.04 vs.0.72±0.05,P＜0.05）；而Tim-4 shRNA組中T淋巴細胞增殖有所增強（0.92±0.07 vs.0.69±0.06,P＜0.05）；⑥FCM檢測發(fā)現(xiàn)AdV-Tim4組中T淋巴細胞凋亡明顯增加（38.42%±7.36%），而抑制Tim-4后T淋巴細胞凋亡率顯著下降（13.98%±4.59%）；⑦ELISA檢測發(fā)現(xiàn)：AdV-Tim

11、4組與T細胞培養(yǎng)液中促炎細胞因子（TNF-α、IL-1β、IFN-γ）分泌減少，抗炎細胞因子（IL-10）分泌增加（P＜0.05），而Tim-4抑制組呈相反趨勢。
　　結論：①過表達Tim-4可調(diào)控活化的KCs分泌譜改變，其機制可能與Tim-4抑制了LPS/TLR4/NF-kB、LPS/MAPK及IRF3通路活性有關；②過表達KCs中Tim-4可抑制KCs表面共刺激分子（MHC-II、CD80、CD86、CD40等）的表達，同時M

12、2型KCs表型分子表達增加；③過表達Tim-4能有效抑制KCs的抗原提呈功能，抑制T淋巴細胞的增殖及促進活化T細胞凋亡。
　　第二部分、KCs中Tim-4表達變化在小鼠肝移植免疫耐受誘導的作用研究
　　目的：經(jīng)門靜脈灌注供肝轉染過表達Tim-4或Tim-4-shRNA慢病毒，觀察增強或抑制KCs中Tim-4表達對肝移植后AcR程度的影響，并探討其相關機制。
　　方法：①采用改良“雙袖套”法建立BALB/c→C3H小鼠肝

13、移植急性排斥反應模型；②受體隨機分為三組（n=30只/組）：Tim-4過表達組（AdV-Tim4 group）；Tim-4抑制組（Tim-4 shRNA group）；錯義序列對照組(control group)。分別于供肝血管吻合完成后經(jīng)門靜脈高壓注射攜帶Tim-4的慢病毒感染供肝；③每組取10只動物觀察各組術后生存時間及生存率，其余受體于術后7d獲取組織及血液標本；④ELISA法檢測血液中TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-1

14、0及TGF-β含量，Real-time PCR檢測肝組織中上述細胞因子的mRNA表達水平，全自動生化儀檢測轉氨酶及膽紅素水平；⑤Western-blot測定肝臟 KCs中Tim-4、p65、p38、ERK1/2、JNK、IRF3及其磷酸化蛋白表達水平；⑥獲取光、電鏡標本觀察病理形態(tài)變化；免疫組織化學染色及激光共聚焦觀察各組移植物中CD4+T細胞和KCs的浸潤情況；TUNEL檢測移植區(qū)T細胞凋亡情況；透射電鏡和激光共聚焦顯微鏡判斷KCs吞

15、噬凋亡細胞情況。
　　結果：①術后第7天，AdV-Tim4組受體生存率以及肝功能較其余兩組得到明顯的改善（P＜0.05）；②HE染色表明AdV-Tim4組RAI評分屬輕度排斥反應，其余兩組則呈重度排斥反應；③PCR結果發(fā)現(xiàn)，細胞因子IL-1β、TNF-α、IFN-γ的mRNA水平在AdV-Tim4組低表達，而IL-10呈高表達（P＜0.05）；外周血ELISA檢測結果與PCR結果一致；④Western-blot檢測到AdV-Tim

16、4組肝臟KCs中Tim-4表達較Control組和Tim4-shRNA組增高（P＜0.05），但p65、p38、ERK1/2、JNK和IRF3的磷酸化蛋白表達水平更低（P＜0.05）；⑤TUNEL顯示AdV-Tim4組匯管區(qū)淋巴細胞凋亡率遠高于Control組和Tim4-shRNA組；⑥免疫組化、激光共聚焦結果提示：與對照組相比，CD4+T細胞及活化KCs在AdV-Tim4組浸潤減少，而在Tim4-shRNA組顯著增加；⑦激光共聚焦顯示