Tim-4在調(diào)控Kupffer細(xì)胞免疫功能及誘導(dǎo)肝移植術(shù)后免疫耐受中的機(jī)制研究.pdf

1、背景：肝移植是目前治療各種終末期肝病的最佳治療手段。而移植術(shù)后急、慢性排斥反應(yīng)、缺血再灌注損傷，與肝臟供體缺乏一起，成為了肝移植領(lǐng)域面臨的主要挑戰(zhàn)。誘導(dǎo)肝移植術(shù)后免疫耐受是避免移植肝臟失功及長(zhǎng)期服用免疫抑制劑的最佳途徑，也是近年移植領(lǐng)域研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。Kupffer細(xì)胞（KCs）作為肝臟的最大巨噬細(xì)胞群，在肝移植免疫中發(fā)揮著極其重要的作用，其機(jī)制與抗原提呈、不同表型下的免疫功能及調(diào)控T淋巴細(xì)胞免疫功能等密切相關(guān)。新近研究發(fā)現(xiàn)，T細(xì)胞免

2、疫球蛋白粘蛋白4(Tcell immunoglobulin domain and mucin domain,Tim-4)參與了Th2細(xì)胞分化、凋亡細(xì)胞吞噬清除、巨噬細(xì)胞功能調(diào)節(jié)等諸多免疫調(diào)控的重要環(huán)節(jié)。但目前為止有關(guān)Tim-4分子的研究主要集中在變態(tài)反應(yīng)性疾病及自身免疫性疾病方面，尚未涉及肝移植免疫。因此，探索Tim-4對(duì)KCs免疫功能及在肝移植術(shù)后免疫調(diào)控中的作用及機(jī)制，可能為誘導(dǎo)肝移植術(shù)后免疫耐受提供新的思路和理論依據(jù)。
　　

3、第一部分、Tim-4表達(dá)變化對(duì)Kupffer細(xì)胞免疫功能調(diào)控的作用研究
　　目的：通過抑制或上調(diào)KCs中Tim-4表達(dá)，觀察Tim-4過表達(dá)及沉默狀態(tài)下對(duì)KCs分泌Th1/Th2類細(xì)胞因子及抗原呈遞作用的影響及相關(guān)機(jī)制。
　　方法：①非連續(xù)梯度離心法分離、培養(yǎng)BALB/c小鼠肝臟KCs，免疫熒光染色及臺(tái)盼藍(lán)染色判斷細(xì)胞純度及活率，吞墨實(shí)驗(yàn)判斷其吞噬功能；②流式細(xì)胞儀及免疫組化檢測(cè)KCs特異性表面分子CD163和CD68的表達(dá)

4、來鑒定KCs；③鑒定后的KCs隨機(jī)分為四組：Tim-4過表達(dá)組（AdV-Tim4 group）；過表達(dá)對(duì)照組（Ctrl-AdV group）；Tim-4抑制組（Tim-4 shRNA group）；抑制對(duì)照組(Ctrl-shRNA group)；分別轉(zhuǎn)染 Tim-4過表達(dá)、抑制及相應(yīng)錯(cuò)義序列慢病毒獲得穩(wěn)定封閉的細(xì)胞群。以LPS（終濃度100ng/mL）活化KCs后作KCs免疫功能相關(guān)檢測(cè)；④免疫熒光及共聚焦顯微鏡檢測(cè)評(píng)估Tim-4相關(guān)慢

5、病毒轉(zhuǎn)染效率；⑤ ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-10、TGF-β表達(dá)水平；⑥ Western Blot及RT-PCR檢測(cè)各組KCs中Tim-4、TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-10、TGF-β蛋白和基因表達(dá)水平；⑦流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)各組KCs的表型分子表達(dá)情況；⑧分離BALB/c小鼠脾細(xì)胞懸液，制備純化T細(xì)胞，F(xiàn)CM檢測(cè)純度，與上述各組KCs共培養(yǎng)，MTT法檢測(cè)T細(xì)胞增殖情況；Ann

6、exin V/PI法觀察T淋巴細(xì)胞凋亡情況；⑩ELISA檢測(cè)T細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-10、TGF-β等細(xì)胞因子含量；?Western-blot測(cè)定KCs中LPS/TLR4/NF-κB及MAPK通路關(guān)鍵蛋白p65、p38、ERK1/2、JNK、IRF3及其磷酸化蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：①KCs細(xì)胞表面特異性分子表達(dá)呈陽(yáng)性，臺(tái)盼藍(lán)染色提示KCs活力＞90%，吞墨實(shí)驗(yàn)證實(shí)其具有良好的吞噬能力；②轉(zhuǎn)染Ti

7、m-4慢病毒后，6h開始KCs即出現(xiàn)熒光表達(dá)，48h前后達(dá)到高峰；Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示: AdV-Tim4組中 Tim-4蛋白水平顯著高于對(duì)照組(1.90±0.41 vs.1.13±0.32, P＜0.05)；而Tim-4 shRNA組中Tim-4的蛋白表達(dá)水平與其對(duì)照組相比較顯著降低(0.52±0.11 vs.1.3±0.31,P＜0.05)；③ FCM檢測(cè)活化的KCs表面共刺激發(fā)現(xiàn)：AdV-Tim4中MHC-II、C

8、D80、CD86、CD40的表達(dá)明顯低于對(duì)照組，而M2型分子CD204和CD206的表達(dá)則高于對(duì)照組；而在Tim-4 shRNA組中，以上分子的表達(dá)則呈相反趨勢(shì)；④ELISA檢測(cè)各組KCs培養(yǎng)液中細(xì)胞因子發(fā)現(xiàn)：在AdV-Tim4組，TNF-α、IL-1β、IFN-γ的表達(dá)與其對(duì)照組比較明顯降低（P＜0.05），而IL-10、TGF-β水平較對(duì)照組表達(dá)增高；在Tim-4抑制組，TNF-α、IL-1β、IFN-γ的表達(dá)較其對(duì)照組增高，而 I

9、L-10、TGF-β的表達(dá)量則呈相反趨勢(shì)（P＜0.05）；同時(shí)，Western Blot證實(shí)KCs中上述細(xì)胞因子的蛋白水平變化與ELISA結(jié)果一致。⑤Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：AdV-Tim4組中KCs內(nèi)Ikkα,IκBα,NF-κB p65，ERKl/2、p38和IRF3的蛋白表達(dá)及其磷酸化水平均受到抑制，JNK蛋白表達(dá)無顯著變化；而在Tim-4 shRNA中，上述蛋白的磷酸化表達(dá)有所增強(qiáng)；⑤T細(xì)胞與各組KCs共培養(yǎng)72h后，

10、MTT結(jié)果表明：AdV-Tim4組T淋巴細(xì)胞的增殖較對(duì)照組受到抑制（0.43±0.04 vs.0.72±0.05,P＜0.05）；而Tim-4 shRNA組中T淋巴細(xì)胞增殖有所增強(qiáng)（0.92±0.07 vs.0.69±0.06,P＜0.05）；⑥FCM檢測(cè)發(fā)現(xiàn)AdV-Tim4組中T淋巴細(xì)胞凋亡明顯增加（38.42%±7.36%），而抑制Tim-4后T淋巴細(xì)胞凋亡率顯著下降（13.98%±4.59%）；⑦ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：AdV-Tim

11、4組與T細(xì)胞培養(yǎng)液中促炎細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1β、IFN-γ）分泌減少，抗炎細(xì)胞因子（IL-10）分泌增加（P＜0.05），而Tim-4抑制組呈相反趨勢(shì)。
　　結(jié)論：①過表達(dá)Tim-4可調(diào)控活化的KCs分泌譜改變，其機(jī)制可能與Tim-4抑制了LPS/TLR4/NF-kB、LPS/MAPK及IRF3通路活性有關(guān)；②過表達(dá)KCs中Tim-4可抑制KCs表面共刺激分子（MHC-II、CD80、CD86、CD40等）的表達(dá)，同時(shí)M

12、2型KCs表型分子表達(dá)增加；③過表達(dá)Tim-4能有效抑制KCs的抗原提呈功能，抑制T淋巴細(xì)胞的增殖及促進(jìn)活化T細(xì)胞凋亡。
　　第二部分、KCs中Tim-4表達(dá)變化在小鼠肝移植免疫耐受誘導(dǎo)的作用研究
　　目的：經(jīng)門靜脈灌注供肝轉(zhuǎn)染過表達(dá)Tim-4或Tim-4-shRNA慢病毒，觀察增強(qiáng)或抑制KCs中Tim-4表達(dá)對(duì)肝移植后AcR程度的影響，并探討其相關(guān)機(jī)制。
　　方法：①采用改良“雙袖套”法建立BALB/c→C3H小鼠肝

13、移植急性排斥反應(yīng)模型；②受體隨機(jī)分為三組（n=30只/組）：Tim-4過表達(dá)組（AdV-Tim4 group）；Tim-4抑制組（Tim-4 shRNA group）；錯(cuò)義序列對(duì)照組(control group)。分別于供肝血管吻合完成后經(jīng)門靜脈高壓注射攜帶Tim-4的慢病毒感染供肝；③每組取10只動(dòng)物觀察各組術(shù)后生存時(shí)間及生存率，其余受體于術(shù)后7d獲取組織及血液標(biāo)本；④ELISA法檢測(cè)血液中TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-1

14、0及TGF-β含量，Real-time PCR檢測(cè)肝組織中上述細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)水平，全自動(dòng)生化儀檢測(cè)轉(zhuǎn)氨酶及膽紅素水平；⑤Western-blot測(cè)定肝臟 KCs中Tim-4、p65、p38、ERK1/2、JNK、IRF3及其磷酸化蛋白表達(dá)水平；⑥獲取光、電鏡標(biāo)本觀察病理形態(tài)變化；免疫組織化學(xué)染色及激光共聚焦觀察各組移植物中CD4+T細(xì)胞和KCs的浸潤(rùn)情況；TUNEL檢測(cè)移植區(qū)T細(xì)胞凋亡情況；透射電鏡和激光共聚焦顯微鏡判斷KCs吞

15、噬凋亡細(xì)胞情況。
　　結(jié)果：①術(shù)后第7天，AdV-Tim4組受體生存率以及肝功能較其余兩組得到明顯的改善（P＜0.05）；②HE染色表明AdV-Tim4組RAI評(píng)分屬輕度排斥反應(yīng)，其余兩組則呈重度排斥反應(yīng)；③PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、IFN-γ的mRNA水平在AdV-Tim4組低表達(dá)，而IL-10呈高表達(dá)（P＜0.05）；外周血ELISA檢測(cè)結(jié)果與PCR結(jié)果一致；④Western-blot檢測(cè)到AdV-Tim

16、4組肝臟KCs中Tim-4表達(dá)較Control組和Tim4-shRNA組增高（P＜0.05），但p65、p38、ERK1/2、JNK和IRF3的磷酸化蛋白表達(dá)水平更低（P＜0.05）；⑤TUNEL顯示AdV-Tim4組匯管區(qū)淋巴細(xì)胞凋亡率遠(yuǎn)高于Control組和Tim4-shRNA組；⑥免疫組化、激光共聚焦結(jié)果提示：與對(duì)照組相比，CD4+T細(xì)胞及活化KCs在AdV-Tim4組浸潤(rùn)減少，而在Tim4-shRNA組顯著增加；⑦激光共聚焦顯示