Kupffer細胞和IL-15對HBV免疫耐受的作用機制研究.pdf

1、肝臟是一個獨特的器官，它既是人體最大的代謝和解毒器官，同時也被認為是機體重要的免疫器官。與其它免疫器官主要誘導免疫應答不同，肝臟更傾向于誘導免疫耐受如口服免疫耐受，肝臟移植耐受等。一些病原菌如乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus，HBV）、丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，HCV)和瘧疾等利用肝臟誘導免疫耐受的特性在肝臟局部形成慢性感染，嚴重危害人類健康。
　　HBV主要感染肝實質細胞，部分人群感染HB

2、V后會導致終生攜帶，HBV攜帶者對HBV疫苗處于免疫耐受狀態(tài)。長期以來，人們對于HBV誘導免疫耐受的機理研究主要基于HBV轉基因鼠，但HBV轉基因鼠免疫系統從胚胎期對HBV病毒就完全處于免疫耐受狀態(tài)，與人類后天感染HBV狀態(tài)有較大差別。本研究中我們采用pAAV/HBV1.2質粒高壓注射的方式建立HBV慢性攜帶小鼠動物模型，研究了HBV慢性攜帶誘導外周免疫耐受的機理和HBV感染初期肝臟局部微環(huán)境改變對HBV免疫耐受的影響。一方面，我們發(fā)現

3、Kupffer細胞在誘導HBV攜帶鼠外周免疫耐受過程中發(fā)揮重要作用;另一方面，肝臟過表達IL-15能夠預防pAAV/HBV1.2質粒高壓注射形成的免疫耐受狀態(tài)。
　　本研究中，我們采用對C57BL/6小鼠高壓注射pAAV/HBV1.2質粒的方式建立HBV持續(xù)攜帶動物模型，模擬人類HBV慢性感染狀態(tài)。運用放射免疫方法定量檢測血清中HBsAg、HBeAg、Anti-HBs含量，免疫組化方法檢測肝臟組織HBcAg表達，熒光定量PCR方法

4、檢測血清中HBV DNA含量，利用以上指標評價pAAV/HBV1.2質粒高壓注射后HBV攜帶情況;通過細胞清除、細胞純化和細胞轉輸實驗觀察特定細胞亞群在HBV誘導外周免疫耐受過程中的作用;采用構建重組表達質粒和高壓注射的方式在小鼠體內內源性過表達IL-15;利用流式細胞術檢測各細胞亞群的變化特征;利用ELISA方法檢測血清中細胞因子含量的變化。采用上述研究方法，我們得到了以下結果:
　　1、Kupffer細胞介導HBV免疫耐受

5、r>　　pAAV/HBV1.2質粒高壓注射小鼠后血清中能檢測到HBsAg、HBeAg持續(xù)表達，高壓注射6周后肝臟組織仍可以檢測到HBcAg蛋白，血清轉氨酶在HBV質粒攜帶過程中一直維持在正常水平，這暗示HBV質粒攜帶鼠的免疫狀態(tài)與處于免疫耐受狀態(tài)的人類慢性HBV攜帶者的免疫狀態(tài)相似。與人類HBV感染現象相一致，我們發(fā)現HBV疫苗預先免疫可以促進小鼠排斥HBV;HBV質粒攜帶鼠在HBV疫苗免疫后，不能產生Anti-HBs，HBV疫苗免疫也

6、不能促進HBV質粒攜帶鼠排斥HBV，這表明肝臟表達HBV誘導外周對HBV疫苗處于免疫耐受狀態(tài)。進一步我們對HBV質粒攜帶鼠免疫非HBV蛋白抗原OVA，發(fā)現HBV攜帶鼠可以對OVA產生免疫應答，這說明肝臟表達HBV誘導外周免疫耐受只針對HBV蛋白，是抗原特異性的。
　　我們將HBV質粒攜帶鼠和對照鼠的脾臟淋巴細胞轉輸到獲得性免疫系統缺陷的Rag1-/-鼠中，在Rag1-/-鼠上分別重建它們的外周免疫系統，觀察重建的免疫系統對HBV疫

7、苗的反應。實驗結果表明，重建了對照鼠免疫系統的Rag1-/-鼠能對HBV疫苗產生應答，而重建了HBV攜帶鼠免疫系統的Rag1-/-鼠不能對HBV疫苗產生應答。接著，我們將HBV攜帶鼠脾臟淋巴細胞中的CD4+T細胞替換為對照鼠的CD4+T細胞，再轉輸給Rag1-/-鼠，發(fā)現對照鼠的CD4+T細胞能輔助HBV攜帶鼠的獲得性免疫系統對HBV疫苗產生免疫應答。這暗示HBV攜帶鼠免疫耐受狀態(tài)可能是由于其CD4+T細胞功能缺陷造成的。
　　肝

8、臟抗原遞呈細胞被證明在誘導肝臟免疫耐受過程中起重要作用。HBV攜帶鼠的非實質細胞轉輸到Na(i)ve鼠中能誘導受者鼠對HBV疫苗低免疫應答，進一步將肝臟非實質細胞分為Kupffer細胞和非Kupffer細胞再分別進行轉輸，我們發(fā)現Kupffer細胞具有很強的誘導受者鼠低免疫應答的能力，這表明Kupffer細胞介導了HBV免疫耐受。不過，檢測Kupffer細胞在pAAV/HBV1.2質粒高壓注射前后的變化情況，我們發(fā)現Kupffer細胞的

9、狀態(tài)并沒有顯著改變，這暗示肝臟Kupffer細胞一直處于誘導免疫耐受的狀態(tài)。
　　2、肝臟過表達IL-15誘導產生IFN-β預防HBV免疫耐受
　　為了研究IL-15對HBV免疫耐受的影響，我們構建了含IL-15基因表達框的pLIVE-IL-15質粒，通過高壓注射的方式使pLIVE-IL-15質粒在小鼠體內過表達IL-15。實驗結果表明，pLIVE-IL-15質粒高壓注射小鼠后能在體內長期表達。若將pLIVE-IL-15質粒

10、或對照質粒pLIVE-EGFP與pAAV/HBV1.2質粒一起注射到小鼠體內，我們發(fā)現對照質粒組小鼠血清中長期表達HBsAg和HBeAg，而pLIVE-IL-15質粒注射組血清中低表達HBsAg和HBeAg并且HBV最終會被清除。這表明IL-15能有效預防HBV免疫耐受狀態(tài)形成。
　　IL-15是一種多能性細胞因子，對天然免疫系統細胞和獲得性免疫系統細胞都具有調節(jié)作用。pLIVE-IL-15質粒在Rag1-/-鼠中仍能有效地抑制H

11、BV表達，這表明IL-15發(fā)揮抗HBV功能不依賴于獲得性免疫系統。盡管脾臟和肝臟NK細胞在IL-15質粒注射后數目有較大提升，但采用PK136抗體清除NK/NKT細胞并不影響IL-15抗HBV功能，采用IL-2Rγc-/-鼠實驗也表明IL-15抗HBV能力不依賴于NK細胞。
　　IFN-γ和IFN-α/β均可以抑制HBV表達。IL-15在IFN-γ缺陷鼠中仍具有抗HBV功能，這表明IL-15抗HBV能力不依賴于IFN-γ。研究發(fā)現

12、，肝臟IFN-βmRNA和血清IFN-β蛋白水平在IL-15質粒注射后顯著上調，而肝臟IFN-αmRNA和血清IFN-α蛋白水平在IL-15質粒注射后變化不明顯。進一步采用Anti-IFNAR1抗體阻斷IFN-β功能可以完全逆轉IL-15的抗HBV作用，這說明IL-15抗HBV功能依賴于IFN-β。Clodronate Lyposomes清除巨噬細胞不會改變IL-15的抗HBV作用，暗示IFN-β并不是由IL-15作用于巨噬細胞產生的。

13、
　　結論:pAAV/HBV1.2質粒高壓注射模型很好地模擬了人類HBV慢性感染狀況，可以用于研究HBV感染誘導外周免疫耐受的現象及機理。我們發(fā)現HBV免疫耐受狀態(tài)與CD4+T細胞功能缺陷相關，Kupffer細胞在誘導HBV免疫耐受過程中發(fā)揮關鍵作用。細胞因子IL-15通過誘導產生IFN-β有效預防HBV免疫耐受狀態(tài)的形成。本研究對于認識肝臟獨特的免疫耐受特性，對于理解HBV慢性感染誘導外周免疫耐受的機理及HBV治療都具有一定意義