PDE4抑制劑咯利普蘭對阿爾茨海默病的抗氧化作用.pdf

1、目的:建立大腦雙側海馬注射Aβ25-35的阿爾茨海默病(Alzheimer's disease)大鼠模型,并采用過氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)誘導氧化應激損傷的PC12細胞作為神經損傷的細胞模型,從抗氧化機制探討咯利普蘭(Rolipram,Rol)對AD大鼠的保護作用。
　　 方法:從在體和離體兩方面來研究咯利普蘭對AD的抗氧化作用。
　　 1.在體實驗
　　 (1)AD模型的建立及分組

2、與給藥成年雄性SD大鼠大腦雙側海馬注射Aβ25-35,造成AD模型后隨機分為5組:假手術組(大腦雙側海馬注射無菌生理鹽水)、模型組(Aβ25-35組)、咯利普蘭低劑量組(0.1 mg/kg)、咯利普蘭中劑量組(0.5 mg/kg)、咯利普蘭高劑量組(1.25 mg/kg)。動物造模24h后,假手術組和模型組給予生理鹽水(10 ml/kg,ip),其余各組腹腔注射給予10％DMSO無菌生理鹽水配制的藥物。
　　 (2)AD大鼠學習

3、記憶能力行為學測試AD大鼠注射Aβ25—35后,第14-15天進行避暗實驗,第16-25天進行水迷宮實驗。
　　 (3)AD大鼠病理組織學觀察AD大鼠水迷宮實驗后處死取腦,多聚甲醛溶液中避光保存做HE染色和尼氏染色的病理切片。
　　 (4)AD大鼠活性氧簇與抗氧化酶系統(tǒng)的測定AD大鼠水迷宮實驗后處死取腦,分離海馬和皮層,根據(jù)試劑盒說明書檢測海馬和皮層中羥自由基(·OH)、超氧陰離子(·O2-)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽

4、(GSH)、一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)和乳酸脫氫酶(LDH)水平。采用Western blot法測定海馬和皮層中硫氧還蛋白(thiorcdoxin,Trx)和誘導型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白表達水平。采用Real time-RT-PCR法測定海馬和皮層中Trx和iNOS mRNA表達水平。
　　 2.離體實驗:
　　 (1)H2O2誘導的細胞損傷模型的建立PC12細胞常規(guī)培養(yǎng),培養(yǎng)液每天更換一次,2-3

5、天傳代接種。細胞加藥處理前采用血清饑餓法使之同步化。加入H2O2(終濃度20～200μmol/L)分別孵育4、6、8、12、18 h,用噻唑藍(MTT)法確立PC12細胞損傷模型。
　　 (2)咯利普蘭對H2O2誘導氧化應激損傷的PC12細胞的保護作用細胞用咯利普蘭和H2O2處理后,收集細胞培養(yǎng)液,MTT法測定細胞活力；根據(jù)乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒說明檢測細胞外LDH水平,用以檢測細胞膜通透性及完整性。收集細胞,用流式細胞術測

6、定細胞周期分布。
　　 (3)咯利普蘭對H2O2誘導氧化應激損傷的PC12細胞的抗氧化保護作用細胞用咯利普蘭和H2O2處理后,收集細胞培養(yǎng)液,試劑盒測定細胞培養(yǎng)液中·OH、·O2-、MDA、GSH、NO和SOD水平。采用Western blot法測定細胞內Trx和iNOS蛋白表達水平。采用Real time-RT-PCR法測定細胞內Trx和iNOS mRNA表達水平。
　　 結果:從在體和離體兩方面結果來研究咯利普蘭對A

7、D的影響。
　　 1.在體實驗
　　 (1)咯利普蘭對AD大鼠學習記憶能力的影響反復注射PDE4抑制劑咯利普蘭能夠顯著性改善AD大鼠在被動回避實驗和水迷宮的行為學。表現(xiàn)為在注射Aβ25-35之后第14-15天,AD大鼠在明箱停留時間較短,咯利普蘭各劑量處理組大鼠則停留時間較長,對暗箱不可逃避的電刺激有較牢固的記憶。在水迷宮測試中,大鼠在水迷宮靶向獲得性試驗中需要更長的時間(與假手術相比)才能找到平臺,而咯利普蘭各劑量處理

8、組大鼠尋找平臺的時間縮短；而且,在探索性實驗(移去平臺)中,經咯利普蘭各劑量干預的AD大鼠在目標象限(即曾經放置平臺的象限)空間探索的時間延長。在可見平臺測試中,各組大鼠尋找平臺的時間均無顯著性差異,排除了手術對動物一般活動行為的影響。
　　 (2)咯利普蘭對AD大鼠病理組織學的影響HE染色:假手術組海馬CA1區(qū)神經元細胞排列整齊均勻,細胞結構完整。模型組海馬CA1區(qū)有結構較松散的軟化灶,部分神經細胞呈缺血性形態(tài),胞體縮小,胞核

9、固縮,細胞數(shù)減少,胞間距離增大,神經元排列紊亂?？├仗m各劑量組海馬CA1區(qū)正常神經細胞數(shù)目較多,排列較密,胞核圓或橢圓形,核仁清晰,染色質豐富,少見固縮變性的神經細胞。
　　 尼氏染色:假手術組海馬CA1區(qū)神經元排列整齊,胞體較大、細胞層次清晰,胞質內尼氏體數(shù)量多。模型組海馬CA1區(qū)神經元結構模糊,數(shù)目減少,神經元排列明顯疏松,皺縮成三角形或錐形,神經元胞體和樹突內尼氏體溶解消失?？├仗m各劑量組海馬CA1區(qū)神經元排列整齊,神

10、經元胞質內尼氏體較模型組增多。
　　 (3)咯利普蘭對AD大鼠活性氧簇與抗氧化酶系統(tǒng)的影響SD大鼠注射Aβ25-35后,海馬和皮層抑制·OH和·O2-活性能力顯著性下降(P<0.01),與模型組相比,咯利普蘭各劑量組海馬和皮層抑制·OH和·O2-活性能力顯著性增加(P<0.05),具有劑量依賴性趨勢。
　　 SD大鼠注射Aβ25-35后,海馬和皮層MDA、LDH和NO水平顯著性提高(P<0.01),GSH水平和SOD活性

11、顯著性下降(P<0.01)。與模型組相比,咯利普蘭各劑量組海馬和皮層中MDA、LDH和NO水平顯著性降低(P<0.05),GSH水平和SOD活性顯著性升高(P<0.05),具有劑量依賴性趨勢。
　　 Western blot結果顯示,SD大鼠注射Aβ25-35后:海馬Trx蛋白表達水平顯著性降低,iNOS蛋白表達水平顯著性升高(P<0.01),咯利普蘭各劑量組均能顯著性提高海馬Trx蛋白表達水平,降低海馬iNOS蛋白表達水平(P

12、<0.05),具有劑量依賴性趨勢,但皮層Trx和iNOS蛋白表達水平各組間均沒有顯著性差異。
　　 Real time-RT-PCR結果顯示,SD大鼠注射Aβ25-35后:海馬和皮層TrxmRNA表達水平顯著性差異降低,iNOS mRNA表達水平顯著性差異提高(P<0.01)?？├仗m各劑量組均能顯著性提高海馬。Trx mRNA表達水平,降低海馬iNOS mRNA表達水平(P<0.01),具有劑量依賴性趨勢?？├仗m0.5mg/

13、kg和1.25mg/kg組能顯著性提高皮層Trx mRNA表達水平,降低皮層iNOS mRNA表達水平(P<0.01)。
　　 2.離體實驗
　　 (1)H2O2誘導的PC12細胞損傷模型倒置顯微鏡下觀察,空白對照組細胞貼壁生長牢固,體積飽滿,充分伸展,而損傷組PC12細胞體積明顯縮小,突起消失,胞體變小,細胞間隙增大,細胞分布變稀疏的,出現(xiàn)不同程度的脫壁。損傷程度隨H2O2濃度的升高加深。MTT實驗結果顯示,與空白對照

14、組相比,H2O2(終濃度40μmol/L)作用16h能顯著性降低細胞活力(P<0.01),且該濃度較溫和,為適宜的濃度和作用時間。
　　 (2)咯利普蘭對H2O2誘導氧化應激損傷的PC12細胞的保護作用MTT結果顯示:與正常對照組相比,H2O2(終濃度40μmol·L-1)作用16 h能顯著性降低細胞的存活率(P<0.05),細胞存活率為57.8％。不同濃度的咯利普蘭預孵均能顯著性降低H2O2對細胞的毒性作用(P<0.05),且

15、具有濃度依賴性。
　　 LDH結果顯示:H2O2損傷組PC12細胞,膜外LDH水平顯著升高(P<0.01),咯利普蘭20μmol·L-1與40μmol·L-1兩濃度可顯著性降低膜外LDH水平(P<0.01)。
　　 流式細胞術結果顯示,H2O2刺激下,G0/G1期細胞分布百分比明顯升高(P<0.01),S期細胞分布百分比明顯降低(P<0.01)?？├仗m(20和40μmol·L-1)顯著減少G0/G1期細胞分布百分比(P

16、<0.05),增加S期細胞分布百分比(P<0.01),(3)咯利普蘭對H2O2誘導損傷PC12細胞抗氧化保護作用H2O2可以使細胞清除·OH和·O2-的能力明顯下降(P<0.01)?？├仗m各濃度組均可不同程度地提高細胞清除·OH和·O2-的能力(P<0.01),且具有濃度依賴性趨勢。
　　 H2O2損傷后,PC12細胞培養(yǎng)上清液中MDA和NO水平明顯升高(P<0.01),GSH含量和SOD活性明明顯降低(P<0.01)。咯利普

17、蘭各濃度組均可顯著性降低細胞培養(yǎng)上清液中MDA和NO水平(P<0.01),提高GSH含量(P<0.05),具有濃度依賴性趨勢；咯利普蘭40μmol·L-1組顯著性提高PC12細胞培養(yǎng)上清液中SOD活性(P<0.01)。
　　 Western blot結果顯示,H2O2使細胞內Trx蛋白水平明顯降低(P<0.01),iNOS蛋白水平明顯提高(P<0.01)?？├仗m各濃度組均能明顯提高Trx表達(P<0.01),具有濃度依賴性的趨

18、勢；咯利普蘭40μmol·L-1組能明顯降低iNOS表達(P<0.01)。
　　 Real time-RT-PCR結果顯示,H2O2處理后,Trx mRNA下調(P<0.01),iNOSmRNA上調(P<0.01)。咯利普蘭各濃度組均能顯著性上調Trx mRNA(P<0.01),下調iNOS mRNA(P<0.05),具有濃度依賴性的趨勢。
　　 結論:我們采用大腦雙側海馬注射Aβ25-35造AD大鼠模型,以及采用H2O

19、2誘導PC12細胞損傷造成神經損傷體外模型,在體與離體給予咯利普蘭干預,通過生化指標及病理的指標觀察咯利普蘭對AD的抗氧化作用,主要結論如下:
　　 (1)咯利普蘭對AD大鼠具有抗氧化保護作用,主要表現(xiàn)在:反復注射咯利普蘭能明顯改善AD大鼠的學習記憶能力；顯著性改善大鼠海馬CA1區(qū)的病理損傷；明顯提高AD大鼠海馬和皮層中抗氧化酶系統(tǒng)活性和硫氧還蛋白系統(tǒng)的調節(jié)能力,抑制氧自由基及iNOS-NO通路的激活。
　　 (2)咯利