豬源腦心肌炎病毒GXLC株致病性研究.pdf

1、腦心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)可以引起以仔豬急性腦炎、心肌炎及母豬繁殖障礙為特征的傳染性疾病。EMCV可以感染小鼠,導(dǎo)致心肌炎、腦炎、糖尿病等。本研究通過(guò)將豬源EMCV GXLC株感染小鼠和斷乳仔豬,來(lái)分析該病毒的致病性。
　　 根據(jù)發(fā)表在GenBank EMCV保守序列3D基因、小鼠和豬促炎細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6、iNOS及管家基因β-actin,分別設(shè)計(jì)特異性

2、引物和探針,構(gòu)建含有各自目的基因序列的重組質(zhì)粒作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品,建立相應(yīng)的TaqMan real-time PCR檢測(cè)方法。用標(biāo)準(zhǔn)品所構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)(R2)達(dá)到0.998以上;可以檢測(cè)到標(biāo)準(zhǔn)品下限濃度為1×101copies/μL;與FMDV、CSFV、PRRSV、PRV、PCV2和BHK-21細(xì)胞所獲得的DNA或cDNA為模板無(wú)交叉反應(yīng)。檢測(cè)促炎細(xì)胞因子和管家基因時(shí),只有每種因子的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng);組

3、內(nèi)與組間試驗(yàn)的變異系數(shù)均在2％以下。上述試驗(yàn)結(jié)果證明,我們建立的TaqMan real-time PCR方法靈敏度高,特異性強(qiáng),重復(fù)性好,可用于EMCV、小鼠及豬的細(xì)胞因子的檢測(cè)和定量分析。
　　 為研究豬源EMCV GXLC株對(duì)小鼠和仔豬的致病性,將其接種4周齡健康BALB/c小鼠和斷乳仔豬。觀察臨床癥狀,觀察大體病理變化及組織病理變化,檢測(cè)心、腦、脾組織病毒含量,檢測(cè)心、腦、脾組織中細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6、

4、iNOS mRNA水平,并測(cè)定小鼠心臟/體重比值和血清中IL-1β、TNF-α蛋白含量,同時(shí)檢測(cè)豬血清抗體滴度。結(jié)果表明:(1)感染小鼠表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)癥狀,多數(shù)小鼠在出現(xiàn)癥狀后24 h內(nèi)死亡;仔豬感染后,體溫升高,表現(xiàn)出明顯精神萎靡等癥狀。(2)剖檢小鼠發(fā)現(xiàn)心臟有明顯的白色壞死灶,腦出血;仔豬發(fā)現(xiàn)心臟膨大、心肌變軟,腦充血,淋巴結(jié)腫大、充血。(3)感染小鼠的心重/體重比值顯著升高,血清中IL-1β、TNF-α蛋白含量升高;豬血清中可檢

5、測(cè)到高滴度的抗EMCV抗體。(4)感染小鼠和仔豬腦、心、脾、血清中檢測(cè)到大量病毒,并且其含量與臨床癥狀、病理?yè)p害等密切相關(guān)。(5)小鼠和仔豬組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),腦組織神經(jīng)細(xì)胞變性、壞死,大腦皮層微血管有出血和炎性細(xì)胞浸潤(rùn),心臟組織大面積心肌細(xì)胞壞死、組織降解、萎縮和彌漫性炎癥;組織病理變化的評(píng)分值顯著升高。(6)感染小鼠和仔豬的心、腦、脾組織中IL-1β、TNF-α、IL-6、iNOS mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào),而且細(xì)胞因子表達(dá)的高峰期