腦心肌炎病毒3C蛋白抑制IFN-β信號(hào)通路.pdf

1、腦心肌炎病毒（Encephalomyocarditis virus，EMCV）是引起仔豬發(fā)病的一種較重要的病原，可以引起仔豬腦炎、心肌炎和心肌周圍炎，以及母豬繁殖障礙，并使其他成年豬呈隱性感染狀態(tài)，表現(xiàn)出亞臨床癥狀，給養(yǎng)豬業(yè)帶來較大經(jīng)濟(jì)損失。本病毒還能感染人類和其他動(dòng)物，可能誘發(fā)自然疫源性人獸共患病，但致病機(jī)制尚不十分清楚。EMCV3C蛋白是病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白之一，具有蛋白酶作用，同時(shí)能裂解宿主蛋白，對(duì)該病毒的致病力有較大影響。本研究構(gòu)建

2、了表達(dá)EMCV3C蛋白的真核表達(dá)載體，通過體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染，觀察了天然免疫IFN-β信號(hào)通路相關(guān)分子的變化，為闡明EMCV致病機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。具體研究?jī)?nèi)容如下:
　　1.EMCV3C蛋白的真棱表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定
　　本研究以EMCV NJ08株基因?yàn)榛A(chǔ)，設(shè)計(jì)引物，通過RT-PCR擴(kuò)增了EMCV的3C基因片段，克隆到真核表達(dá)載體pVAX1上，經(jīng)雙酶切和測(cè)序鑒定得到了正確的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-3C。然后在脂質(zhì)體2000的

3、介導(dǎo)下，將該重組真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到HeLa細(xì)胞，間接免疫熒光和western blot實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，重組的3C蛋白得到了正確的表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物的分子量與預(yù)期相符，為進(jìn)行3C蛋白的功能研究打下良好基礎(chǔ)。
　　2.EMCV3C蛋白對(duì)IFN-β信號(hào)通路分子的影響
　　本研究將pVAX1-3C質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人的HeLa細(xì)胞，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，pVAX1-3C轉(zhuǎn)染組中IFN-β、IRF3及PRDⅡ啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光素酶的表達(dá)量明

4、顯低于陰性對(duì)照組，表明3C蛋白能抑制IFN-β的產(chǎn)生。Realtime-PCR結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染了pVAX1或GST真核表達(dá)質(zhì)粒的HeLa細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染了pVAX1-3C的HeLa細(xì)胞在受到IFN-β刺激后，ISG15、ISG56、Mx1、OAS、PKR的相對(duì)表達(dá)量降低。ISRE啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果為，pVAX1-3C抑制了ISRE啟動(dòng)子的活性，表明3C蛋白能抑制IFN發(fā)揮作用的下游信號(hào)通路。Western blot結(jié)果顯示，