腦心肌炎病毒河南流行株病原學、診斷方法和疫苗的研究.pdf

1、腦心肌炎(EMC)是由腦心肌炎病毒（EMCV）引起的種以腦炎、心肌炎和繁殖障礙為主要臨診特征的人畜共患傳染病。自然條件下，鼠類是其自然貯存宿主和傳播者，感染最廣泛和受危害最嚴重的動物是豬，人感染發(fā)病也時有發(fā)生。國內(nèi)于2005年成功分離到首株病毒，現(xiàn)已證實豬群中感染極為普遍，但抗體陽性率差異顯著。盡管尚未發(fā)生嚴重疫情，但其威脅日趨嚴重。河南省地處中原，為養(yǎng)殖大省，加之地理環(huán)境復雜，生物多樣性豐富，嚙齒類動物種類繁多、活動頻繁，為EMCV的

2、發(fā)生、傳播和流行提供了客觀條件，但迄今為止，關于本病在河南省的流行病學情況、病原學特征、診斷及防控技術等各項研究均為空白。本文通過對6株不同動物源EMCV河南地方流行株進行分離鑒定、全基因組測序解析、診斷方法建立、致病性試驗、基因表達和聯(lián)合疫曲研究，以期豐富我國EMC的基礎理論和臨床應用研究，將該病潛在的嚴重威脅降至最低。
　　1.不同動物源EMCV河南流行株的分離、鑒定及全基因組測序解析
　　為研究EMCV對不同動物的感染

3、情況，本文應用“細胞接種與RT-PCR相結(jié)合”方法，成功分離到國內(nèi)首株地方土豬源、首株家養(yǎng)野豬源、3株良種豬源和1株鼠源EMCV。由此證實EMCV已存河南省豬場中存在;EMCV可引起不同動物感染，提醒在進行地方品種養(yǎng)殖和野生動物家養(yǎng)時要充分考慮人獸共患疫病傳播的生態(tài)學。
　　6株分離毒的基因組序列全長7724 bp～7735 bp不等，彼此間高度同源，與國內(nèi)豬源、鼠源分離毒處于同一分支。各基因片段中，以VP1和2A變異幅度最大，V

4、P2和3D最為保守。系統(tǒng)進化樹顯示，EMCV可分為G1、G2和G33個群。6株分離毒與國內(nèi)其他參考毒同屬于G1群，但分布并不完全集中，對鼠均具有高致病性。推測鼠是不同豬種之間EMCV交叉感染、傳播與流行的重要媒介。不同的EMCV地方流行株間存在較大的地域差異，其傳播具有一定的區(qū)域限制性。
　　2.EMCV診斷方法的研究
　　建立快速、特異和敏感的檢測方法對本病的診斷、流行病學調(diào)查、病原學研究及疫苗研發(fā)等至關重要。本文以地方土

5、豬源EMCV HNXX13的VP1基因為靶序列，建立了SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR方法，特異性強，重復性良好，靈敏度高，可為EMCV的分子流行病學調(diào)查、疫情監(jiān)測、病原學研究和快速診斷等提供技術平臺。對家養(yǎng)野豬源EMCV JZ1202的VP1基因進行原核表達和鑒定，并以該重組蛋白作為包被抗原，建立了檢測血清抗體的間接ELISA方法。臨床初步應用結(jié)果表明，受檢的河南省部分豬場陽性場檢出率為65.87％，血清總陽性率為45.30％

6、。不同規(guī)模和不同階段豬群均存在EMCV感染，中小型豬場的陽性率顯著高于規(guī)模化豬場。EMCV與豬圓環(huán)病毒2型（PCV-2）的混合感染率高達75.14％。本研究填補了河南省EMCV分子流行病學和血清流行病學監(jiān)測的空白。
　　3.PCV-2所致免疫抑制條件下繼發(fā)感染EMCV對仔豬的影響
　　研究了PCV-2所致免疫抑制條件下繼發(fā)感染EMCV對仔豬生長和致病性的影響。發(fā)現(xiàn)PCV-2先期感染可使EMCV對仔豬表現(xiàn)出更為嚴重的致病性和致

7、死性。仔豬相繼感染PCV-2和EMCV后，淋巴細胞比率及EMCV中和抗體較長時間維持在低水平。研究結(jié)果表明，EMCV單獨感染組后第1d到第9d可從豬肛門拭子檢測、分離到病毒，而相繼感染組的排毒期則可持續(xù)至感染后第12 d，提示先感染 PCV-2可延長EMCV感染豬的排毒期。
　　4.EMCV/PCV-2二聯(lián)滅活疫苗的研制和免疫效力測定
　　國外已成功研制出EMC滅活疫苗，與其他疾病的聯(lián)合疫苗的研究尚未見報道。本文研制出EMC

8、V/PCV-2二聯(lián)滅活疫曲，接種小鼠和仔豬后發(fā)現(xiàn)，免疫效果均高于相應單曲，并可產(chǎn)生各自的高水平抗體，可完全有效抵抗EMCV和PCV-2強毒株的攻擊，為2種疾病的聯(lián)合免疫提供了可能，達到“一針防兩病”的效果，滿足了EMCV免疫的潛在需求。
　　5.EMCV VP1基因在桿狀病毒中的表達及其免疫原性研究
　　應用昆蟲桿狀病毒表達EMCV國內(nèi)流行株VP1基因的相關研究極少。本文根據(jù)桿狀病毒密碼子的偏嗜性，對EMCV河南流行毒JZ1

9、201的VP1基因進行優(yōu)化和人工合成，利用桿狀病毒表達系統(tǒng)獲得可穩(wěn)定表達VP1蛋白的重組桿狀病毒。免疫小鼠后能產(chǎn)生針對EMCV的高水平特異性中和抗體，且明顯高于EMCV全病毒滅活苗，并可明顯提高淋巴細胞的分裂、增殖能力，免疫原性良好，為進一步研究其功能以及亞單位疫苗、診斷抗原的研發(fā)奠定基礎。
　　綜上所述，本文為研究我國EMCV的流行病學監(jiān)測體系、致病機理、快速診斷、免疫機理以及新型疫苗研制等奠定堅實基礎，從而為有效防控該病提供科