氧化苦參堿對ConA誘導(dǎo)小鼠肝損傷的保護(hù)作用及機(jī)制初探.pdf

1、乙型病毒性肝炎（乙肝）是由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的疾病，在我國廣泛流行，隨著科學(xué)家對乙肝致病機(jī)制的深入研究，人們逐漸認(rèn)識到乙肝相關(guān)肝損傷與宿主免疫應(yīng)答密切相關(guān)。
　　山豆根是豆科植物越南槐Sophora tonkinensis Gapnep.的干燥根及根莖，是臨床上治療慢性乙肝的常用中藥之一。前期研究表明，山豆根中主要化學(xué)成分氧化苦參堿(oxymatrine OMT)具有調(diào)節(jié)免疫、保肝降酶的作用，但是目前國內(nèi)外對其保肝機(jī)制

2、的研究還較少。為此本課題采用刀豆蛋白（Concanavalin A Con A）模型模擬乙肝相關(guān)免疫性肝損傷，從免疫調(diào)控和抗氧化應(yīng)激兩個角度探討OMT對該模型的保護(hù)作用及可能機(jī)制，以期為闡釋OMT治療乙肝的機(jī)制提供前期數(shù)據(jù)支持。
　　第一部分、基于免疫調(diào)控的氧化苦參堿抑制Con A誘導(dǎo)小鼠肝損傷作用研究
　　目的：從免疫調(diào)控角度研究氧化苦參堿（OMT）抑制Con A誘導(dǎo)小鼠肝損傷作用及其機(jī)制
　　方法：
　　1.

3、Con A誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷模型的建立：
　　取5-6周齡，18-22g Balb/c小鼠，隨機(jī)分成空白組，Con A5mg·kg-1組，Con A10mg·kg-1組，Con A15mg·kg-1組，Con A20mg·kg-1組，每組6只，空白組尾靜脈注射生理鹽水，其余組尾靜脈注射Con A。8h后，小鼠摘眼球取血，檢測血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）活性；取肝組織大葉進(jìn)行HE染色。
　　2. OMT對Con A誘導(dǎo)的小鼠肝損

4、傷的干預(yù)作用
　　取5-6周齡，18-22g Balb/c小鼠，隨機(jī)分成空白組（A組），Con A15mg·kg-1組（B組），雙環(huán)醇（陽性藥）156mg·kg-1治療組（C組），OMT60mg·kg-1治療組組（D組），OMT120mg·kg-1治療組（E組），每組6只，B、C、D、E組分別尾靜脈注射15mg·kg-1的Con A，造急性肝損傷模型，同時D、E組分別腹腔注射檢測OMT進(jìn)行干預(yù)，C組造模之前半小時灌胃給藥，A組給相

5、同劑量的生理鹽水，8h后取樣檢測血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）活性以及血清總膽紅素(TBIL)的水平。取肝組織大葉進(jìn)行HE染色
　　3.采用luminex多因子檢測方法檢測小鼠體內(nèi)細(xì)胞因子的表達(dá)水平，篩選OMT可能的免疫調(diào)控機(jī)制。
　　4.采用流式細(xì)胞術(shù)檢測脾淋巴細(xì)胞中Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞亞群的比例。
　　結(jié)果：
　　1.Con A誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷模型的建立：
　　結(jié)果顯示隨

6、著Con A劑量的增加，ALT值逐漸增加，當(dāng)造模劑量達(dá)到15mg·kg-1時，ALT值升高到1032.08±85.62U·L-1，肝組織切片HE染色顯示，Con A5mg·kg-1組，肝組織未出現(xiàn)嚴(yán)重的死亡灶，只是在肝竇有明顯的充血現(xiàn)象，匯管區(qū)有較輕微的炎癥細(xì)胞浸潤；Con A10mg·kg-1組，肝竇充血明顯，肝組織出現(xiàn)較嚴(yán)重的死亡灶，并且有輕微的炎癥細(xì)胞浸潤；Con A15mg·kg-1組，肝竇充血明顯，匯管區(qū)出現(xiàn)大量的炎癥細(xì)胞浸潤

7、，并且出現(xiàn)片狀的肝組織壞死區(qū)域；Con A20mg·kg-1組，小鼠全部死亡。綜上所述，當(dāng)給予Con A的造模劑量達(dá)到15mg·kg-1時，小鼠ALT值升高明顯，肝組織出現(xiàn)明顯的片狀死亡區(qū)域，因此本課題組采用此濃度造模進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2.OMT對Con A誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷的治療作用：
　　2.1 血清生化指標(biāo)檢測：與A相比，B組ALT、AST、TBIL值均顯著升高（P<0.01）。與B組相比，C組ALT值顯著下降（P

8、<0.05），未降低到正常值水平，AST和TBIL降低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；D組ALT和TBIL值顯著降低(P<0.05)，AST值降低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；E組ALT值顯著降低（P<0.01），未降低到正常值水平，AST和TBIL值均顯著降低（P<0.05），未降低到正常值水平。
　　2.2 肝組織切片HE染色結(jié)果：與A相比，B組肝細(xì)胞水腫，肝竇充血明顯，匯管區(qū)出現(xiàn)大量的炎癥細(xì)胞浸潤，并且出現(xiàn)大面積肝組織

9、壞死。與B組相比，C組肝竇充血未減輕，匯管區(qū)依然有大量的炎癥細(xì)胞浸潤，但組織壞死癥狀減輕；D組肝竇充血癥狀未減輕，匯管區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤減輕，肝組織小灶樣壞死；E組肝竇充血癥狀減輕，匯管區(qū)有少量炎癥細(xì)胞浸潤，肝組織小灶樣壞死。
　　3.OMT對小鼠血清細(xì)胞因子的影響：
　　與A組比，B組血清中白細(xì)胞介素17（IL-17）的水平顯著升高（P<0.01），白細(xì)胞介素10（IL-10）的水平顯著升高（P<0.01）；與B組相比，E組血

10、清中IL-17的水平顯著下降（P<0.01），IL-10的水平顯著上升（P<0.05）。這說明OMT可能對輔助性T細(xì)胞17（Th17）和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的分化有影響。
　　4.OMT對TH17細(xì)胞和Treg細(xì)胞的影響：
　　與A相比，B組中與引起自身免疫反應(yīng)，造成肝組織損傷的Th17細(xì)胞比例顯著上升(P<0.05)；具有抑制自身免疫反應(yīng)，保護(hù)肝組織損傷的Treg細(xì)胞比例顯著上升(P<0.05)。與B組相比，D組Th1

11、7細(xì)胞比例均顯著下降（P<0.05），E組Th17細(xì)胞比例顯著下降（P<0.05）；D組Treg細(xì)胞比例有所上升，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），E組Treg細(xì)胞比例顯著上升（P<0.05）。
　　結(jié)論：OMT通過抑制引起自身免疫反應(yīng)，造成肝組織損傷的 Th17細(xì)胞的分化和促進(jìn)具有抑制自身免疫反應(yīng)，保護(hù)肝組織損傷的Treg細(xì)胞的分化，從而實(shí)現(xiàn)其調(diào)節(jié)免疫，保肝降酶作用。
　　第二部分、基于抗氧化應(yīng)激的氧化苦參堿抑制Con A誘

12、導(dǎo)小鼠肝損傷作用研究
　　目的：從抗氧化應(yīng)激角度研究氧化苦參堿（OMT）抑制Con A誘導(dǎo)小鼠肝損傷作用及機(jī)制
　　方法：
　　1.動物實(shí)驗(yàn)：在第一部分動物水平轉(zhuǎn)氨酶及病理結(jié)果基礎(chǔ)上檢測各組小鼠肝臟組中與氧化應(yīng)激相關(guān)的超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）的活性；
　　2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：采用雙氧水（H2O2）誘導(dǎo)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞L02建立氧化應(yīng)激損傷模型，在細(xì)胞水平上進(jìn)一步研OMT的抗氧化作用。CCK

13、-8（cell counting kit-8）試劑盒檢測OMT對L02細(xì)胞增殖活性的影響；H2O2誘導(dǎo)的L02細(xì)胞氧化應(yīng)激模型條件的篩選；流式檢測OMT對H2O2誘導(dǎo)的L02細(xì)胞凋亡率的影響；分析OMT對H2O2誘導(dǎo)的L02細(xì)胞內(nèi)ROS水平、GSH-PX和SOD活性的影響，探討OMT抗氧化機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1.動物實(shí)驗(yàn)：與空白組相比，模型組中SOD和GSH-PX的活性顯著降低（P<0.05）；與模型組相比，OMT60m

14、g·kg-1治療組和OMT120mg·kg-1治療組小鼠肝臟內(nèi)SOD和GSH-PX活性均顯著增強(qiáng)(P<0.01)；OMT120mg·kg-1治療組小鼠肝臟內(nèi)二者活性增強(qiáng)最為明顯。
　　2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：CCK-8結(jié)果顯示OMT在6.25μg·ml-1至100μg·ml-1的劑量范圍內(nèi)不同程度增強(qiáng)L02細(xì)胞增殖活性，當(dāng)劑量范圍大于200μg·ml-1時，L02細(xì)胞的增值活性降低，即對L02細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，因此本課題組選擇6.25μg·

15、ml-1、12.5μg·ml-1、25μg·ml-1、50μg·ml-1四個無毒劑量進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明 OMT劑量在6.25μg·ml-1、12.5μg·ml-1、25μg·ml-1、50μg·ml-1時均可抑制H2O2誘導(dǎo)的L02細(xì)胞凋亡，且OMT劑量在12.5μg·ml-1時L02細(xì)胞的凋亡率最低；在上述四個劑量下，OMT能夠抑制H2O2誘導(dǎo)的L02細(xì)胞內(nèi)活性氧ROS水平的升高，并且增強(qiáng)GSH-PX和SOD的活性。