苦參堿抗大腸癌作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景
　　 苦參堿是從我國傳統(tǒng)中藥苦參的干燥根中提取出的一種生物堿活性成分,具有廣泛的藥理學(xué)作用。近年來的研究表明,苦參堿能在體內(nèi)外抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長,并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。目前,國家大力提倡對(duì)祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)寶庫中的傳統(tǒng)中草藥進(jìn)行開發(fā)研究,采用分子生物學(xué)手段對(duì)其藥理學(xué)作用給予新的解釋,致力于研究開發(fā)出新的抗癌藥物,來大力弘揚(yáng)祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué),已成為當(dāng)前中醫(yī)藥研究的發(fā)展趨勢。在這樣的大背景下,深入探討苦參堿抑制腫瘤尤其是抑制實(shí)體瘤

2、方面的作用,揭示其體內(nèi)外抗癌作用的分子機(jī)制,無疑是一項(xiàng)很有前景和研究價(jià)值的課題,是非常有意義的。
　　 目的：
　　 明確苦參堿是否具有抗大腸癌的作用并探討其機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.苦參堿對(duì)大腸癌細(xì)胞增殖能力的影響
　　 2.苦參堿誘導(dǎo)大腸癌SW480細(xì)胞凋亡的研究
　　 3.苦參堿對(duì)昆明小鼠的毒性研究
　　 4.苦參堿的體內(nèi)抑瘤作用
　　 5.苦參堿對(duì)昆明小鼠免疫

3、器官的影響
　　 6.苦參堿對(duì)大腸癌SW480細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA水平的影響
　　 7.苦參堿對(duì)大腸癌SW480細(xì)胞Caspase家族和Bcl-2蛋白表達(dá)水平的影響
　　 8.苦參堿對(duì)大腸癌SW480細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB家族的影響
　　 結(jié)果
　　 1.苦參堿對(duì)大腸癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響1.1苦參堿對(duì)不同腫瘤細(xì)胞增殖的影響MTT結(jié)果顯示,苦參堿0.25mg/ml作用于細(xì)胞24h后,與陰

4、性對(duì)照組相比,SW480、SW480-EGFP和Lovo細(xì)胞的增殖明顯受到抑制(P<0.05),而SW620、MGCS03、SGC7901、Eca109和MCF-7五種細(xì)胞株與對(duì)照組相比則無顯著性差異(P>0.05)。隨著苦參堿劑量的增加,腫瘤細(xì)胞的生長抑制率也隨之升高,表明苦參堿以劑量依賴方式抑制腫瘤細(xì)胞的增殖?？鄥A對(duì)不同細(xì)胞的增殖抑制能力為SW480-EGFP>SW480>SGC7901>MGC803>SW620>Eca109>L

5、ovo>MCF-7,提示苦參堿對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的生長抑制有一定的針對(duì)性。對(duì)胃腸道腫瘤細(xì)胞株的生長抑制作用較強(qiáng),而對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞則較弱。
　　 1.2苦參堿對(duì)大腸癌SW480和SW620細(xì)胞增殖的影響苦參堿對(duì)SW480細(xì)胞的生長抑制有效濃度從0.25mg/ml開始,而SW620細(xì)胞則從0.50mg/ml開始。隨著藥物濃度的增加和作用時(shí)間的延長,苦參堿對(duì)SW480和SW620細(xì)胞的生長抑制作用也就更明顯。在低濃度(0.25、0

6、.50、1.00mg/ml)時(shí)呈時(shí)間與劑量依賴性,但高濃度(1.50、2.00mg/ml)時(shí),苦參堿在48h可將SW480細(xì)胞全部殺死。相同濃度下,SW620細(xì)胞的生長抑制率在24h和48h差異不顯著(P>0.05),而72h與24h、48h相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說明苦參堿對(duì)SW620細(xì)胞的生長抑制作用在48h后顯著增強(qiáng)。另外,與SW620細(xì)胞相比,相同濃度的苦參堿對(duì)SW480細(xì)胞的生長抑制作用更強(qiáng)。
　　 形態(tài)學(xué)觀

7、察結(jié)果顯示,苦參堿處理后的SW480和SW620細(xì)胞胞體縮小,胞漿中出現(xiàn)大量空泡以及形成所謂的“印戒樣細(xì)胞”。
　　 1.3苦參堿對(duì)SW480和SW620細(xì)胞周期和凋亡的影響不同劑量苦參堿處理SW480和SW620細(xì)胞24h以后,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期結(jié)果顯示,隨著苦參堿劑量的增加,G1期細(xì)胞比例增加,S期減少,而G2/M期變化不明顯。細(xì)胞增殖指數(shù)降低。0.25和0.50mg/ml苦參堿均可誘導(dǎo)SW480細(xì)胞發(fā)生凋亡,有凋亡峰出

8、現(xiàn)；而SW620細(xì)胞則沒有明顯凋亡峰出現(xiàn)。
　　 苦參堿對(duì)細(xì)胞周期的影響作用與濃度成正比,具有明顯的劑量依賴性,顯示苦參堿可有效抑制SW480細(xì)胞周期的正常轉(zhuǎn)換,使細(xì)胞在G1期堆積,導(dǎo)致細(xì)胞阻滯于G0/G1期,從而阻止細(xì)胞的有絲分裂,使細(xì)胞增殖受到抑制。
　　 2.苦參堿誘導(dǎo)SW480細(xì)胞凋亡的研究2.1AnnexinV標(biāo)記法檢測苦參堿誘導(dǎo)SW480細(xì)胞凋亡AnnexinV法檢測到0.50mg/ml苦參堿作用SW480細(xì)

9、胞24、48h后,細(xì)胞凋亡率分別是(3.77±0.47)％和(22.73±1.78)％,與對(duì)照組自發(fā)凋亡率(1.26±0.31)％相比均有顯著性差異(P<0.05)。
　　 2.2苦參堿誘導(dǎo)SW480細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化AO/EB熒光雙染、Hoechst33342熒光染色和Tunel染色結(jié)果顯示,苦參堿0.50mg/ml作用SW480細(xì)胞24和48h后,熒光顯微鏡觀察到SW480細(xì)胞呈典型的凋亡形態(tài)變化。早期凋亡細(xì)胞細(xì)胞變圓、不

10、貼壁、質(zhì)膜腫脹、膜發(fā)泡,核固縮；晚期凋亡細(xì)胞核染色質(zhì)固縮,斷裂或凋亡小體形成等等。透射電鏡下可見凋亡細(xì)胞核染色質(zhì)凝聚、邊集,部分細(xì)胞核膜消失,細(xì)胞漿出現(xiàn)空泡,細(xì)胞表面微絨毛消失,胞膜完整。
　　 2.3瓊脂糖凝膠電泳檢測凋亡的DNA凋亡的細(xì)胞在電泳時(shí)會(huì)出現(xiàn)特征性的DNA梯狀條帶。我們用不同劑量苦參堿處理細(xì)胞后,提取總DNA進(jìn)行電泳。結(jié)果表明,苦參堿干預(yù)48h后的細(xì)胞出現(xiàn)明顯的DNALadder梯狀條帶,而對(duì)照組和苦參堿作用12、

11、24h后的細(xì)胞DNA不顯現(xiàn),72h時(shí)可見隱約的梯狀條帶,但主要為彌散的壞死條帶。由此可以明確,苦參堿在體外能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　 3.苦參堿對(duì)昆明小鼠的毒性研究急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,昆明小鼠對(duì)苦參堿的耐受劑量大于80mg/kg。將苦參堿對(duì)小鼠的致死中量(LD50)的檢測結(jié)果進(jìn)行Probit統(tǒng)計(jì)分析,回歸方程為PROBIT=6.54359-14.37149X,χ2=0.247,P=0.970,擬合良好?？鄥A的半數(shù)致死劑量(即Pr

12、ob=0.50)時(shí)為157.13mg/kg,其95％可信區(qū)間為(88.08-280.31)mg/kg。
　　 4.苦參堿的體內(nèi)抑瘤作用各實(shí)驗(yàn)組裸鼠皮下接種SW480-EGFP細(xì)胞7d后,借助整體熒光成像系統(tǒng)觀察,可見皮下瘤塊發(fā)出明亮綠色熒光,成瘤率100％。
　　 與N.S.對(duì)照組相比,從給藥第14d(即接種瘤細(xì)胞21d)開始,Mhigh組和5-Fu組抑制腫瘤生長的作用有顯著性意義(P=0.046,P=0.020),但M

13、low組與對(duì)照組相比則無顯著性差異(P=0.169)。至給藥后28d裸鼠處死,Mhigh組裸鼠的移植瘤體積為(136.38±104.97)mm3,與N.S.對(duì)照組的(488.64±143.73)mm3相比有顯著性差異(P=0.005)；而與5-Fu組的(128.44±28.85)mm3相比無顯著性差異(P=1.000)。Mlow處理組裸鼠的移植瘤體積為(333.29±73.00)mm3,與N.S對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.257)。

14、提示低劑量苦參堿對(duì)裸鼠移植瘤的生長抑制能力較弱,而高劑量則能顯著抑制腫瘤生長。
　　 移植瘤質(zhì)量結(jié)果表明,Mlow組、Mhigh組和5-Fu組的抑瘤率分別為11.90％、59.52％和65.38％。腫瘤組織光鏡及透射電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果顯示,用藥組除見到大量壞死細(xì)胞外,尚有凋亡細(xì)胞存在。
　　 5.苦參堿對(duì)昆明小鼠免疫器官指數(shù)的影響與陰性對(duì)照組相比,苦參堿組小鼠的胸腺、脾臟和肝臟指數(shù)均無顯著變化(P>0.05)；5-Fu

15、組小鼠胸腺和脾臟指數(shù)均顯著降低(P<0.01)?？鄥A+5-Fu組小鼠的胸腺指數(shù)與對(duì)照組相比顯著降低(P<0.01)。
　　 苦參堿+5-Fu組小鼠脾臟指數(shù)與5-Fu組相比均有顯著性差異(P<0.01),與對(duì)照組、苦參堿組比較無顯著性差異(P>0.05)；提示苦參堿可以拮抗5-Fu對(duì)脾臟的免疫抑制,使脾臟指數(shù)增加。
　　 病理組織學(xué)光鏡觀察結(jié)果顯示,苦參堿組小鼠胸腺和脾臟沒有明顯的萎縮和破壞,肝臟組織無明顯病理變化。5-

16、Fu組小鼠胸腺和脾臟皮質(zhì)萎縮,淋巴細(xì)胞數(shù)目減少,髓質(zhì)內(nèi)組織細(xì)胞和纖維細(xì)胞增生明顯；苦參堿+5-Fu組小鼠胸腺和脾臟的病理改變與5-Fu組類似,但病變程度稍輕。
　　 6.苦參堿對(duì)大腸癌SW480細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的影響結(jié)果表明caspase-3、NF-κB1基因mRNA隨苦參堿作用時(shí)間的延長,表達(dá)量逐漸增加,Bcl-2表達(dá)逐漸降低,IKKβ表達(dá)略有增加,而p53和IκB-α表達(dá)量變化不大。
　　 7.苦參堿

17、對(duì)細(xì)胞中Caspase家族和Bcl-2蛋白表達(dá)影響苦參堿0.50mg/ml作用SW480細(xì)胞24h后,caspase-3被激活,發(fā)生剪切,并隨著作用時(shí)間的延長而增多,說明caspase-3的激活具有時(shí)間依賴性。caspase-7只在48h時(shí)被激活,而caspase-9只在8h時(shí)被激活,表明這兩種蛋白的激活具有時(shí)間特異性。Bcl-2在苦參堿作用8h后表達(dá)減少,隨著作用時(shí)間的延長,其表達(dá)量逐漸降低。
　　 8.苦參堿對(duì)大腸癌SW48

18、0細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB家族的影響結(jié)果顯示,苦參堿0.50mg/ml作用24h后,未磷酸化的IKKα和IKKβ表達(dá)降低,磷酸化IKKβ表達(dá)增多,磷酸化的IKKα未檢測出。未磷酸化和磷酸化的IκBα表達(dá)均增加。磷酸化p65的表達(dá)隨著作用時(shí)間的延長而增加。表明苦參堿主要通過經(jīng)典途徑激活NF-κB通路。
　　 結(jié)論
　　 1.苦參堿在體外能以劑量和時(shí)間依賴的方式抑制大腸癌SW480和SW620細(xì)胞增殖；
　　 2.苦