抗豬圓環(huán)病毒2型卵黃抗體的研制及效果的研究.pdf

1、本研究制備了抗豬圓環(huán)病毒2型特異性卵黃抗體,研究了抗體體外和小鼠體內(nèi)抑制病毒增殖的能力。主要研究內(nèi)容如下:
　　 1.抗豬圓環(huán)病毒2型特異性卵黃抗體的制備
　　 選取32只22周齡健康產(chǎn)蛋雞,隨機(jī)分為4組,每組8只,每只為一個重復(fù)。對照組注射生理鹽水,試驗(yàn)組1:用滅活的PCV2與弗氏佐劑乳化后逐次增加劑量免疫蛋雞；試驗(yàn)組2:用滅活的PCV2與弗氏佐劑乳化后保持相同劑量免疫蛋雞；試驗(yàn)組3:用PCV2免疫蛋雞；共免疫五次。用

2、ELISA和膠體金兩種方法檢測蛋雞血清抗體和卵黃抗體水平,水稀釋-硫酸銨一次鹽析-二次鹽析-透析-濃縮提取IgY,BCA法檢測每一次提取后所獲得的蛋白濃度,SDS-PAGE檢測各步驟提取后IgY純度。結(jié)果表明:各試驗(yàn)組蛋雞的血清抗體水平始終高于卵黃抗體水平,試驗(yàn)組1所獲得的抗體效價(jià)最高,最高效價(jià)可達(dá)到1:640,并且持續(xù)時(shí)間較長,持續(xù)時(shí)間可達(dá)8周以上；通過水稀釋-硫酸銨一次鹽析-二次鹽析-透析-濃縮各步驟提取,每10 ml卵黃液最終可獲

3、得卵黃抗體51.67 mg;經(jīng)SDS-PAGE檢測,雜帶較少,抗體純度較高。
　　 2.抗豬圓環(huán)病毒卵黃抗體的體內(nèi)外中和試驗(yàn)
　　 IgY的最大無毒作用濃度的研究:在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,將卵黃抗體倍比稀釋成不同濃度,加入長成良好的細(xì)胞,用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞病變情況；IgY體外中和試驗(yàn):將卵黃抗體倍比稀釋成不同濃度,與200 TCID50的PCV2體外中和1 h后加入長成良好的細(xì)胞,培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞,提取病毒DNA,

4、通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定病毒的拷貝數(shù)；IgY體內(nèi)中和試驗(yàn):選取30只8周齡SPF級BALB/c小鼠,分為3組,陰性對照組:腹腔注射生理鹽水,0.5 ml/只；試驗(yàn)組:IgY與PCV2(107 TCID50/ml)中和一個小時(shí)后腹腔注射,0.5 ml/只；陽性對照組:腹腔注射PCV2(107 TCID50/ml),0.5 ml/只,于7 d、14 d采集血液和組織,檢測小鼠體內(nèi)病毒復(fù)制情況和血清抗體水平。IgY細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果表明:Ig

5、Y不引起細(xì)胞產(chǎn)生CPE,但會促進(jìn)細(xì)胞的生長,產(chǎn)生細(xì)胞堆積,并且隨著IgY濃度的降低,堆積現(xiàn)象逐漸減少,當(dāng)IgY濃度為0.9 mg/ml時(shí),堆積現(xiàn)象消失；IgY體外中和試驗(yàn)表明:當(dāng)IgY的濃度為225μg/ml時(shí),陽性對照組和試驗(yàn)組細(xì)胞中PCV2的拷貝數(shù)存在顯著差異,處理組IgY抑制了病毒的復(fù)制,并且隨著IgY濃度的增加,病毒的拷貝數(shù)逐漸降低；IgY體內(nèi)中和試驗(yàn)結(jié)果表明:當(dāng)IgY濃度為100 mg/ml時(shí),IgY能夠明顯抑制小鼠組織中PC