糖尿病患者唾液中3種氨基酸光學(xué)異構(gòu)體定量分析方案及其應(yīng)用.pdf

1、糖尿病是威脅人類健康的第三大疾病，可在初期階段因無痛無癢,沒有明顯的癥狀，往往得不到早期的診斷和治療,所以有待開發(fā)低侵襲性的早期診斷方法。唾液是人體重要的體液之一，可以作為診斷疾病的生物樣品，但目前尚未有將其應(yīng)用于糖尿病診斷的文獻(xiàn)報(bào)道。
　　本研究首次建立并完善了一種能夠應(yīng)用于人體唾液中氨基酸光學(xué)異構(gòu)體定量的超高效液相（UPLC）-熒光（FL）分析方法。本文以人體唾液為生物樣品，設(shè)計(jì)開發(fā)了D,L-丙氨酸（Alanine，Ala）、

2、D,L-纈氨酸（Valine，Val）、D,L-亮氨酸（Leucine，Leu）3種D,L-氨基酸的UPLC-FL技術(shù)。以6-Aminocaproic acid(Internal standard;IS)為內(nèi)標(biāo)物，用熒光衍生化試劑R(-)-4-N，N-二甲基磺酰胺-7-（3-異氰酸吡咯烷）-2,1,3-苯并氧雜咪唑，即R(-)-DBD-PyNCS與3種D,L-氨基酸光學(xué)異構(gòu)體以及3％的三乙胺在55℃下加熱20分鐘進(jìn)行衍生化反應(yīng)；用BEH

3、 C18(1.7m,100mm×2.1mm i.d.)色譜柱,以0.2%的甲酸水溶液和0.2%的甲酸乙腈溶液為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫；利用UPLC-FL在激發(fā)波長(zhǎng)（Ex）：460nm，熒光波長(zhǎng)（Em）：550nm處進(jìn)行衍生化產(chǎn)物的檢測(cè)。在20分鐘內(nèi)3種D，L-氨基酸的分離度（Rs）大于1.5，達(dá)到了完全分離。標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r2≥0.9988）；最低檢測(cè)限為10.0-200fmol；日內(nèi)、日間精密度RSD均小于10.44％；加

4、樣回收率為95.2-109.6%，均滿足生物樣品測(cè)定的要求。本方法準(zhǔn)確、靈敏、可靠、專屬性強(qiáng)，可用于人體唾液中3種D,L-氨基酸的定量。
　　利用健康者及糖尿病患者的唾液，建立了3種氨基酸光學(xué)異構(gòu)體定量分析方案，并探討其在糖尿病診斷中的可行性。收集了17名健康受試者的唾液（男性10名、女性7名）；以HbA1C為診斷指標(biāo)，收集了28名糖尿病受試者的唾液（男性15名、女性13名）。在受試的健康者及糖尿病患者的唾液中均檢測(cè)出3種D，L-

5、氨基酸。糖尿病癥受試者唾液中的3種D,L-氨基酸平均含量明顯高于健康受試者。健康者的男性與糖尿病的男性受試者的唾液中L-Ala、D,L-Val、D,L-Leu有顯著性差異（p＜0.05），而D-Ala沒有顯著性差異；全體健康者與糖尿病癥受試者的唾液中D,L-Ala、D,L-Val、L-Leu有顯著性差異（p＜0.01）,而D-Leu沒有顯著性差異。因此，L-Ala、D,L-Val、L-Leu的定量值可作為一種糖尿病癥診斷的新的生物標(biāo)記物