NK細(xì)胞活化性受體NKp30的表達(dá)與功能研究.pdf

1、固有免疫(innate immunity)是生物體在物種進(jìn)化過程中形成的一系列防御機(jī)制,能迅速的對(duì)侵入的病原體產(chǎn)生非特異性抗感染免疫應(yīng)答,同時(shí)固有免疫在適應(yīng)性免疫應(yīng)答過程中也起著重要作用。天然殺傷細(xì)胞(natural killer cells,NK)是固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分,在機(jī)體防御病原微生物感染和抗腫瘤方面發(fā)揮著重要的作用。NK細(xì)胞的活化受其表面活化性與抑制性受體的協(xié)同調(diào)控,自然細(xì)胞毒性受體(natural cytotoxici

2、ty receptors,NCRs)是NK細(xì)胞特有的活化性受體,通常在NK細(xì)胞表面抑制性受體喪失識(shí)別“自我”能力時(shí),發(fā)揮殺傷作用。NKp30(NCR3)是NCR家族的一個(gè)重要成員,表達(dá)于所有NK細(xì)胞表面,在NK細(xì)胞活化以及殺傷腫痛的過程中發(fā)揮重要作用,近幾年研究表明,NKp30分子參與NK細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DC)的交互調(diào)節(jié)(crosstalk),實(shí)現(xiàn)對(duì)固有免疫和適應(yīng)性免疫的調(diào)控。NKp30分子的功能在過去

3、10年里得到了研究者廣泛的關(guān)注,但NKp30分子在NK細(xì)胞的活化及免疫突觸形成中的確切作用機(jī)制尚不清楚。本研究中,我們構(gòu)建了人NKp30胞外段結(jié)構(gòu)域原核細(xì)胞表達(dá)載體,獲得有生物學(xué)活性的NKp30重組蛋白。我們采用NKp30重組蛋白免疫小鼠,制備了抗NKp30的單克隆抗體。我們利用免疫熒光、51Cr同位素釋放實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)(FACS)和免疫印跡(Western blotting)實(shí)驗(yàn)對(duì)NKp30分子在NK細(xì)胞活化及NK細(xì)胞免疫突觸形成中

4、的作用進(jìn)行了研究。
　　 主要取得了以下結(jié)果:
　　 1,NKp30分子胞外段結(jié)構(gòu)域蛋白的表達(dá)與純化
　　 構(gòu)建NKp30胞外段結(jié)構(gòu)域蛋白的原核細(xì)胞重組表達(dá)載體,通過誘導(dǎo)表達(dá),重組蛋白以包涵體形式存在,經(jīng)過Western blotting和質(zhì)譜鑒定,目的蛋白為人NKp30重組蛋白(簡稱rhNKp30)。分別采用稀釋復(fù)性法和鎳柱親和層析法對(duì)rhNKp30進(jìn)行復(fù)性和純化,蛋白純度可以達(dá)到95％以上。經(jīng)FACS檢測(cè)rh

5、NKp30能夠與NKp30配體陽性細(xì)胞結(jié)合,51Cr釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示rhNKp30能夠抑制NK92細(xì)胞對(duì)Hela細(xì)胞的殺傷。結(jié)果提示rhNKp30具有生物學(xué)活性,可用于功能研究。
　　 2,抗人NKp30單克隆抗體的制備、鑒定及應(yīng)用
　　 用rhNKp30免疫8-10周齡的BALB/c雌性小鼠,采取不同的免疫策略,經(jīng)過5次免疫后,取小鼠的脾臟細(xì)胞與骨髓瘤SP2/0細(xì)胞在聚乙二醇作用下進(jìn)行體外融合。通過有限稀釋法和間接酶聯(lián)

6、免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)篩選陽性雜交瘤細(xì)胞株,共獲得了4株能穩(wěn)定分泌抗rhNKp30的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。我們選擇了其中對(duì)NKp30親和力高的克隆號(hào)為3G5的單克隆抗體進(jìn)行了深入研究。常規(guī)方法制備腹水,經(jīng)ProteinG親和層析法純化獲得純度為95%的單克降抗體3G5,并對(duì)該抗體進(jìn)行了特性鑒定和應(yīng)用檢測(cè)。單克隆抗體3G5能廣泛用于Western blotting、免疫沉淀(Immunoprecipitation)、ELISA和FA

7、CS檢測(cè)實(shí)驗(yàn),并且單克隆抗體3G5不影響NK030受體與其配體的結(jié)合。
　　 3,NKp30分子參與NK細(xì)胞活化及免疫突觸形成
　　 通過51Cr同位素釋放實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明抗NKp30阻斷抗體(克隆號(hào):P30-15)能夠明顯抑制外周血NK細(xì)胞或者NK細(xì)胞系NK92細(xì)胞對(duì)多種靶細(xì)胞的殺傷。通過篩選發(fā)現(xiàn)NKp30分子在外周血NK細(xì)胞或者NK92細(xì)胞殺傷Hela細(xì)胞中發(fā)揮著主導(dǎo)作用。為此我們采用NK

8、92細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞,Hela細(xì)胞作為靶細(xì)胞進(jìn)行免疫突觸的研究。采用不同熒光標(biāo)記的抗體的Confocal檢測(cè)結(jié)果顯示:NKp30與CD11a分子共定位而且聚集在NK92細(xì)胞與Hela細(xì)胞的接觸面上,提示NKp30分子參與NK細(xì)胞免疫突觸的形成。通過FACS和免疫熒光檢測(cè)NK92細(xì)胞與Hela細(xì)胞的結(jié)合顯示,在0-15 min內(nèi),NK92細(xì)胞和Hela細(xì)胞的結(jié)合率與孵育時(shí)間成正相關(guān),在15 min達(dá)到最大結(jié)合率,15-30 min效靶細(xì)胞

9、結(jié)合率變化不大?？筃Kp30阻斷抗體不能抑制效靶細(xì)胞的結(jié)合,提示NKp30分子不影響NK細(xì)胞與靶細(xì)胞結(jié)合。FACS檢測(cè)發(fā)現(xiàn),Hela細(xì)胞能刺激NK92細(xì)胞細(xì)胞毒脫顆粒的產(chǎn)生,抗NKp30阻斷抗體能顯著抑制該效應(yīng),提示NKp30分子在NK細(xì)胞脫顆粒效應(yīng)中可能發(fā)揮著重要的作用。ELISA檢測(cè)Hela細(xì)胞能夠刺激NK92細(xì)胞分泌IFN-γ,抗NKp30阻斷抗體能明顯抑制NK92細(xì)胞分泌IFN-γ的水平,說明NKp30分子在NK細(xì)胞分泌細(xì)胞因子

10、方面起著重要作用。通過Western blotting和51Cr同位素釋放實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)PI3K-Erk1/2信號(hào)通路參與NKp30分子介導(dǎo)的NK細(xì)胞活化。
　　 綜上所述:NKp30分子參與NK細(xì)胞活化性免疫突觸的形成,但NKp30分子不影響NK細(xì)胞與靶細(xì)胞的粘附與結(jié)合。NKp30分子識(shí)別靶細(xì)胞上的配體向NK細(xì)胞胞內(nèi)傳遞活化信號(hào),激活PI3K-Erk1/2信號(hào)通路,進(jìn)而誘導(dǎo)NK細(xì)胞的脫顆粒效應(yīng)與細(xì)胞因子的分泌,導(dǎo)致NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞