NK細胞活化性受體NKp30的表達與功能研究.pdf

1、固有免疫(innate immunity)是生物體在物種進化過程中形成的一系列防御機制,能迅速的對侵入的病原體產(chǎn)生非特異性抗感染免疫應答,同時固有免疫在適應性免疫應答過程中也起著重要作用。天然殺傷細胞(natural killer cells,NK)是固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分,在機體防御病原微生物感染和抗腫瘤方面發(fā)揮著重要的作用。NK細胞的活化受其表面活化性與抑制性受體的協(xié)同調(diào)控,自然細胞毒性受體(natural cytotoxici

2、ty receptors,NCRs)是NK細胞特有的活化性受體,通常在NK細胞表面抑制性受體喪失識別“自我”能力時,發(fā)揮殺傷作用。NKp30(NCR3)是NCR家族的一個重要成員,表達于所有NK細胞表面,在NK細胞活化以及殺傷腫痛的過程中發(fā)揮重要作用,近幾年研究表明,NKp30分子參與NK細胞與樹突狀細胞(dendritic cells,DC)的交互調(diào)節(jié)(crosstalk),實現(xiàn)對固有免疫和適應性免疫的調(diào)控。NKp30分子的功能在過去

3、10年里得到了研究者廣泛的關注,但NKp30分子在NK細胞的活化及免疫突觸形成中的確切作用機制尚不清楚。本研究中,我們構建了人NKp30胞外段結(jié)構域原核細胞表達載體,獲得有生物學活性的NKp30重組蛋白。我們采用NKp30重組蛋白免疫小鼠,制備了抗NKp30的單克隆抗體。我們利用免疫熒光、51Cr同位素釋放實驗、流式細胞術(FACS)和免疫印跡(Western blotting)實驗對NKp30分子在NK細胞活化及NK細胞免疫突觸形成中

4、的作用進行了研究。
　　 主要取得了以下結(jié)果:
　　 1,NKp30分子胞外段結(jié)構域蛋白的表達與純化
　　 構建NKp30胞外段結(jié)構域蛋白的原核細胞重組表達載體,通過誘導表達,重組蛋白以包涵體形式存在,經(jīng)過Western blotting和質(zhì)譜鑒定,目的蛋白為人NKp30重組蛋白(簡稱rhNKp30)。分別采用稀釋復性法和鎳柱親和層析法對rhNKp30進行復性和純化,蛋白純度可以達到95％以上。經(jīng)FACS檢測rh

5、NKp30能夠與NKp30配體陽性細胞結(jié)合,51Cr釋放實驗結(jié)果顯示rhNKp30能夠抑制NK92細胞對Hela細胞的殺傷。結(jié)果提示rhNKp30具有生物學活性,可用于功能研究。
　　 2,抗人NKp30單克隆抗體的制備、鑒定及應用
　　 用rhNKp30免疫8-10周齡的BALB/c雌性小鼠,采取不同的免疫策略,經(jīng)過5次免疫后,取小鼠的脾臟細胞與骨髓瘤SP2/0細胞在聚乙二醇作用下進行體外融合。通過有限稀釋法和間接酶聯(lián)

6、免疫吸附試驗(ELISA)篩選陽性雜交瘤細胞株,共獲得了4株能穩(wěn)定分泌抗rhNKp30的單克隆抗體雜交瘤細胞株。我們選擇了其中對NKp30親和力高的克隆號為3G5的單克隆抗體進行了深入研究。常規(guī)方法制備腹水,經(jīng)ProteinG親和層析法純化獲得純度為95%的單克降抗體3G5,并對該抗體進行了特性鑒定和應用檢測。單克隆抗體3G5能廣泛用于Western blotting、免疫沉淀(Immunoprecipitation)、ELISA和FA

7、CS檢測實驗,并且單克隆抗體3G5不影響NK030受體與其配體的結(jié)合。
　　 3,NKp30分子參與NK細胞活化及免疫突觸形成
　　 通過51Cr同位素釋放實驗檢測NK細胞對靶細胞的殺傷,實驗結(jié)果表明抗NKp30阻斷抗體(克隆號:P30-15)能夠明顯抑制外周血NK細胞或者NK細胞系NK92細胞對多種靶細胞的殺傷。通過篩選發(fā)現(xiàn)NKp30分子在外周血NK細胞或者NK92細胞殺傷Hela細胞中發(fā)揮著主導作用。為此我們采用NK

8、92細胞作為效應細胞,Hela細胞作為靶細胞進行免疫突觸的研究。采用不同熒光標記的抗體的Confocal檢測結(jié)果顯示:NKp30與CD11a分子共定位而且聚集在NK92細胞與Hela細胞的接觸面上,提示NKp30分子參與NK細胞免疫突觸的形成。通過FACS和免疫熒光檢測NK92細胞與Hela細胞的結(jié)合顯示,在0-15 min內(nèi),NK92細胞和Hela細胞的結(jié)合率與孵育時間成正相關,在15 min達到最大結(jié)合率,15-30 min效靶細胞

9、結(jié)合率變化不大。抗NKp30阻斷抗體不能抑制效靶細胞的結(jié)合,提示NKp30分子不影響NK細胞與靶細胞結(jié)合。FACS檢測發(fā)現(xiàn),Hela細胞能刺激NK92細胞細胞毒脫顆粒的產(chǎn)生,抗NKp30阻斷抗體能顯著抑制該效應,提示NKp30分子在NK細胞脫顆粒效應中可能發(fā)揮著重要的作用。ELISA檢測Hela細胞能夠刺激NK92細胞分泌IFN-γ,抗NKp30阻斷抗體能明顯抑制NK92細胞分泌IFN-γ的水平,說明NKp30分子在NK細胞分泌細胞因子

10、方面起著重要作用。通過Western blotting和51Cr同位素釋放實驗,發(fā)現(xiàn)PI3K-Erk1/2信號通路參與NKp30分子介導的NK細胞活化。
　　 綜上所述:NKp30分子參與NK細胞活化性免疫突觸的形成,但NKp30分子不影響NK細胞與靶細胞的粘附與結(jié)合。NKp30分子識別靶細胞上的配體向NK細胞胞內(nèi)傳遞活化信號,激活PI3K-Erk1/2信號通路,進而誘導NK細胞的脫顆粒效應與細胞因子的分泌,導致NK細胞對靶細胞