NK細(xì)胞活化性受體CD226的表達(dá)與功能研究.pdf

1、天然免疫系統(tǒng)在皮膚之內(nèi)作為機(jī)體防御外來病原體入侵的第二道屏障，發(fā)揮著非常重要的作用。眾所周知，NK在機(jī)體的天然免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用，殺傷腫瘤細(xì)胞、殺傷病毒感染的細(xì)胞、殺傷胞內(nèi)寄生菌和殺傷真菌。NK細(xì)胞發(fā)揮這些作用主要是依靠其表面各種活化性受體和抑制性受體來實(shí)現(xiàn)的。目前已知的NK細(xì)胞活化性受體包括NKG2D、NKp30、NKp44和CD226等等。它們主要介導(dǎo)NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，介導(dǎo)NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用以及促使NK細(xì)

2、胞各種細(xì)胞因子的分泌。NK細(xì)胞的抑制性受體包括CD94/NKG2A，KIR-L和TIGIT等等，主要發(fā)揮抑制NK細(xì)胞對(duì)組織自身的細(xì)胞的殺傷作用。本文主要探索活化性受體CD226分子的結(jié)構(gòu)功能以及其與相應(yīng)配體的識(shí)別機(jī)制。CD226在NK細(xì)胞上的功能主要包括介導(dǎo)NK細(xì)胞與靶細(xì)胞的粘附，NK細(xì)胞的活化以及NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的細(xì)胞毒作用等等。CD226分子促使LFA-1的聚集并參與免疫突觸的形成。CD226分子是Ⅰ型跨膜蛋白，屬于免疫球蛋白受體超

3、家族成員。在它的胞外N端有兩個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域。CD226分子目前已知的配體有CD112分子和CD155分子，均為Ⅰ型跨膜蛋白。前者屬于Nectin家族，后者是脊髓灰質(zhì)炎病毒受體(PVR)。兩種分子均為粘附分子。但是目前CD226分子和它的兩種配體分子的相互作用機(jī)制尚不明確。本研究中我們構(gòu)建了包含有CD226分子兩個(gè)胞外結(jié)構(gòu)域的CD226ECD片段和只包含有N端第一個(gè)結(jié)構(gòu)域的CD226ECD1片段的原核表達(dá)載體。通過鎳柱純化之后制備出

4、了帶有6His標(biāo)簽的重組蛋白。并對(duì)蛋白功能進(jìn)行了鑒定。
　　主要獲得的結(jié)果有以下幾部分:
　　1.CD226ECD和CD226ECD1片段的表達(dá)純化
　　我們用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)了CD226分子的結(jié)構(gòu)，之后根據(jù)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的結(jié)果截取了相應(yīng)的只包含胞外第一個(gè)結(jié)構(gòu)域的ECD1片段和包含胞外兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的ECD片段。在原核細(xì)胞中和6His標(biāo)簽融合表達(dá)之后發(fā)現(xiàn)是以包涵體形式存在的，我們對(duì)包涵體進(jìn)行了變復(fù)性和鎳柱純化后得到了純度在

5、95％以上的可溶性蛋白。這些蛋白經(jīng)過WesternBlot鑒定和質(zhì)譜鑒定之后確證為我們所需要的目的蛋白。
　　2.CD226ECD1片段和CD226ECD片段的功能鑒定
　　為了更進(jìn)一步確認(rèn)表達(dá)出來的蛋白是否具有生物學(xué)活性。我們首先檢測(cè)了CD226ECD1和CD226ECD片段和CD226配體陽性的Hela、K562等細(xì)胞系的結(jié)合作用。并且采用CD226配體陰性的CHO-K1細(xì)胞系作為陰性對(duì)照，發(fā)現(xiàn)兩種蛋白片段都可以和細(xì)胞結(jié)

6、合。而且這種結(jié)合作用是可以被CD226的阻斷性抗體阻斷的。SPR試驗(yàn)同樣表明兩種蛋白片段都可以和CD155蛋白分子相互作用。之后，我們?yōu)榱烁哟_認(rèn)這種結(jié)合作用的生物學(xué)功能，檢測(cè)了兩種蛋白對(duì)NK-92殺傷靶細(xì)胞的影響。通過4小時(shí)51Cr殺傷試驗(yàn)，兩種蛋白都可以阻斷NK-92對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用。同時(shí)可以阻斷NK細(xì)胞和靶細(xì)胞之間的結(jié)合以及NK細(xì)胞和靶細(xì)胞之間免疫突觸和的形成。最后我們檢測(cè)了NK細(xì)胞胞內(nèi)信號(hào)分子，發(fā)現(xiàn)兩種蛋白都可以抑制ERK通路

7、傳導(dǎo)活化性信號(hào)。綜合上述結(jié)果，CD226分子通過其胞外第一個(gè)結(jié)構(gòu)域識(shí)別其配體分子并發(fā)揮其生物學(xué)作用。
　　3.可溶性CD226片段對(duì)于腫瘤細(xì)胞增殖的影響
　　因?yàn)樵谥暗难芯恐邪l(fā)現(xiàn)正常人的血清中存在一定水平的可溶性CD226(sCD226)，并且在癌癥病人中高表達(dá)。為了探索這種可溶性蛋白的功能，我們構(gòu)建了在N端帶有6His和MBP標(biāo)簽包含全部CD226胞外248個(gè)氨基酸殘基的原核表達(dá)載體。經(jīng)過原核表達(dá)后得到可溶性的融合蛋白，

8、然后用TEV酶將6His和MBP標(biāo)簽切掉之后用鎳柱和分子篩對(duì)蛋白進(jìn)行純化，我們最終拿到了純度在95％以上的不帶任何標(biāo)簽的CD226胞外段全長(zhǎng)可溶性蛋白。用這種蛋白來模擬血清中的可溶性蛋白來研究它對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響。在和腫瘤細(xì)胞共孵育72小時(shí)之后我們對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)可溶性CD226分子可以抑制Hela、K562這兩種CD226配體陽性的腫瘤細(xì)胞系的增殖。并且隨著可溶性蛋白劑量的增大，細(xì)胞數(shù)目也越少。為了進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞數(shù)目減少的機(jī)制。

9、我們檢測(cè)了腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期以及凋亡情況，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞并沒有產(chǎn)生凋亡，但是細(xì)胞周期被延長(zhǎng)了。于是我們通過對(duì)腫瘤細(xì)胞胞內(nèi)信號(hào)的研究發(fā)現(xiàn)Rac1/Cdc42的磷酸化水平增加，表示這個(gè)分子降解增加，可能會(huì)影響細(xì)胞遷移能力。CyclinD1被磷酸的量增多，表示細(xì)胞處于G0期的比例增多。我們通過劃痕試驗(yàn)證實(shí)了CD226可溶蛋白可以抑制Hela細(xì)胞的遷移。
　　綜上所述:CD226分子通過其胞外第一個(gè)結(jié)構(gòu)域參與配體識(shí)別、活化信號(hào)傳導(dǎo)和免疫突觸的形