NK細胞活化性受體CD226的表達與功能研究.pdf

1、天然免疫系統(tǒng)在皮膚之內(nèi)作為機體防御外來病原體入侵的第二道屏障，發(fā)揮著非常重要的作用。眾所周知，NK在機體的天然免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用，殺傷腫瘤細胞、殺傷病毒感染的細胞、殺傷胞內(nèi)寄生菌和殺傷真菌。NK細胞發(fā)揮這些作用主要是依靠其表面各種活化性受體和抑制性受體來實現(xiàn)的。目前已知的NK細胞活化性受體包括NKG2D、NKp30、NKp44和CD226等等。它們主要介導(dǎo)NK細胞對靶細胞的細胞毒作用，介導(dǎo)NK細胞對靶細胞的殺傷作用以及促使NK細

2、胞各種細胞因子的分泌。NK細胞的抑制性受體包括CD94/NKG2A，KIR-L和TIGIT等等，主要發(fā)揮抑制NK細胞對組織自身的細胞的殺傷作用。本文主要探索活化性受體CD226分子的結(jié)構(gòu)功能以及其與相應(yīng)配體的識別機制。CD226在NK細胞上的功能主要包括介導(dǎo)NK細胞與靶細胞的粘附，NK細胞的活化以及NK細胞對靶細胞的細胞毒作用等等。CD226分子促使LFA-1的聚集并參與免疫突觸的形成。CD226分子是Ⅰ型跨膜蛋白，屬于免疫球蛋白受體超

3、家族成員。在它的胞外N端有兩個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域。CD226分子目前已知的配體有CD112分子和CD155分子，均為Ⅰ型跨膜蛋白。前者屬于Nectin家族，后者是脊髓灰質(zhì)炎病毒受體(PVR)。兩種分子均為粘附分子。但是目前CD226分子和它的兩種配體分子的相互作用機制尚不明確。本研究中我們構(gòu)建了包含有CD226分子兩個胞外結(jié)構(gòu)域的CD226ECD片段和只包含有N端第一個結(jié)構(gòu)域的CD226ECD1片段的原核表達載體。通過鎳柱純化之后制備出

4、了帶有6His標簽的重組蛋白。并對蛋白功能進行了鑒定。
　　主要獲得的結(jié)果有以下幾部分:
　　1.CD226ECD和CD226ECD1片段的表達純化
　　我們用生物信息學(xué)方法預(yù)測了CD226分子的結(jié)構(gòu)，之后根據(jù)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測的結(jié)果截取了相應(yīng)的只包含胞外第一個結(jié)構(gòu)域的ECD1片段和包含胞外兩個結(jié)構(gòu)域的ECD片段。在原核細胞中和6His標簽融合表達之后發(fā)現(xiàn)是以包涵體形式存在的，我們對包涵體進行了變復(fù)性和鎳柱純化后得到了純度在

5、95％以上的可溶性蛋白。這些蛋白經(jīng)過WesternBlot鑒定和質(zhì)譜鑒定之后確證為我們所需要的目的蛋白。
　　2.CD226ECD1片段和CD226ECD片段的功能鑒定
　　為了更進一步確認表達出來的蛋白是否具有生物學(xué)活性。我們首先檢測了CD226ECD1和CD226ECD片段和CD226配體陽性的Hela、K562等細胞系的結(jié)合作用。并且采用CD226配體陰性的CHO-K1細胞系作為陰性對照，發(fā)現(xiàn)兩種蛋白片段都可以和細胞結(jié)

6、合。而且這種結(jié)合作用是可以被CD226的阻斷性抗體阻斷的。SPR試驗同樣表明兩種蛋白片段都可以和CD155蛋白分子相互作用。之后，我們?yōu)榱烁哟_認這種結(jié)合作用的生物學(xué)功能，檢測了兩種蛋白對NK-92殺傷靶細胞的影響。通過4小時51Cr殺傷試驗，兩種蛋白都可以阻斷NK-92對靶細胞的殺傷作用。同時可以阻斷NK細胞和靶細胞之間的結(jié)合以及NK細胞和靶細胞之間免疫突觸和的形成。最后我們檢測了NK細胞胞內(nèi)信號分子，發(fā)現(xiàn)兩種蛋白都可以抑制ERK通路

7、傳導(dǎo)活化性信號。綜合上述結(jié)果，CD226分子通過其胞外第一個結(jié)構(gòu)域識別其配體分子并發(fā)揮其生物學(xué)作用。
　　3.可溶性CD226片段對于腫瘤細胞增殖的影響
　　因為在之前的研究中發(fā)現(xiàn)正常人的血清中存在一定水平的可溶性CD226(sCD226)，并且在癌癥病人中高表達。為了探索這種可溶性蛋白的功能，我們構(gòu)建了在N端帶有6His和MBP標簽包含全部CD226胞外248個氨基酸殘基的原核表達載體。經(jīng)過原核表達后得到可溶性的融合蛋白，

8、然后用TEV酶將6His和MBP標簽切掉之后用鎳柱和分子篩對蛋白進行純化，我們最終拿到了純度在95％以上的不帶任何標簽的CD226胞外段全長可溶性蛋白。用這種蛋白來模擬血清中的可溶性蛋白來研究它對腫瘤細胞的影響。在和腫瘤細胞共孵育72小時之后我們對腫瘤細胞進行計數(shù)，發(fā)現(xiàn)可溶性CD226分子可以抑制Hela、K562這兩種CD226配體陽性的腫瘤細胞系的增殖。并且隨著可溶性蛋白劑量的增大，細胞數(shù)目也越少。為了進一步檢測細胞數(shù)目減少的機制。

9、我們檢測了腫瘤細胞的細胞周期以及凋亡情況，發(fā)現(xiàn)細胞并沒有產(chǎn)生凋亡，但是細胞周期被延長了。于是我們通過對腫瘤細胞胞內(nèi)信號的研究發(fā)現(xiàn)Rac1/Cdc42的磷酸化水平增加，表示這個分子降解增加，可能會影響細胞遷移能力。CyclinD1被磷酸的量增多，表示細胞處于G0期的比例增多。我們通過劃痕試驗證實了CD226可溶蛋白可以抑制Hela細胞的遷移。
　　綜上所述:CD226分子通過其胞外第一個結(jié)構(gòu)域參與配體識別、活化信號傳導(dǎo)和免疫突觸的形