NK細(xì)胞活化受體CD226的表達(dá)及功能研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、固有免疫系統(tǒng)作為機(jī)體抵御外來微生物抗原入侵的第一道防線,能直接迅速的活化并對入侵機(jī)體的病原體進(jìn)行清除,在獲得性免疫系統(tǒng)啟動之前發(fā)揮了重要的屏障作用。天然殺傷細(xì)胞(natural killer cells,NK)是固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分,在機(jī)體防御感染和癌癥的免疫應(yīng)答中起著重要作用。NK細(xì)胞的活化受到活化性與抑制性受體的共同調(diào)控,由于識別機(jī)制的多樣化,近年來,NK細(xì)胞表面活化性受體得到了人們的廣泛關(guān)注。 CD226分子是NK

2、細(xì)胞表面活化性受體,近年來研究發(fā)現(xiàn),CD226在NK細(xì)胞的活化并殺傷腫瘤細(xì)胞等生物學(xué)過程中發(fā)揮了重要作用,并與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)。雖然CD226的功能得到了人們的廣泛關(guān)注,但其分子識別與活化機(jī)制仍然不是非常清楚。 本實(shí)驗中,我們構(gòu)建了CD226的胞外不同的結(jié)構(gòu)域蛋白,包括含有N端19-129氨基酸序列的IgⅤ樣結(jié)構(gòu)域ECD1(extracellular domain1),以及含有兩個IgⅤ樣結(jié)構(gòu)域ECD2(extracell

3、ular domain2)(19-243aa)。通過對兩個長度不同的結(jié)構(gòu)域與腫瘤細(xì)胞表面配體蛋白的相互作用進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)CD226蛋白與其配體可能的作用位點(diǎn)與其在腫瘤識別殺傷中的作用機(jī)理;進(jìn)一步通過抗體介導(dǎo)的活化與蛋白阻斷實(shí)驗,探討了CD226分子在NK細(xì)胞活化中的作用機(jī)制。 通過上述研究,我們初步獲得了結(jié)果如下: 1.構(gòu)建載體并原核表達(dá)CD226分子胞外結(jié)構(gòu)域ECD1與ECD2,重組蛋白經(jīng)復(fù)性純化后,蛋白純度達(dá)到95%

4、以上,經(jīng)Western Blot鑒定,蛋白成功表達(dá)。成功構(gòu)建表達(dá)CD226胞外段蛋白的真核表達(dá)載體,經(jīng)過轉(zhuǎn)染并篩選獲得穩(wěn)定高表達(dá)可溶性CD226的CHO-K1細(xì)胞系。 2.發(fā)現(xiàn)CD226分子在NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞識別殺傷中發(fā)揮重要作用,并且CD226分子與配體的識別與結(jié)合主要是通過胞外N端第一個結(jié)構(gòu)域ECD1。蛋白結(jié)合實(shí)驗發(fā)現(xiàn),CD226胞外結(jié)構(gòu)域可以識別并結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面配體,單獨(dú)的ECD1蛋白即可有效與靶細(xì)胞結(jié)合。CD226胞

5、外結(jié)構(gòu)域重組蛋白的加入可以有效阻斷NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),重組蛋白對效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞生長與增殖沒有明顯的影響,重組蛋白對殺傷的阻斷主要是通過阻斷NK細(xì)胞與靶細(xì)胞的結(jié)合實(shí)現(xiàn)的,提示CD226在NK細(xì)胞對靶細(xì)胞的識別中可能發(fā)揮了粘附分子的作用。 3.除粘附作用外,CD226傳遞的活化信號對NK細(xì)胞的活化有著重要的影響??贵w刺激CD226分子活化后可以引起NK細(xì)胞表面活化分子CD69的表達(dá)升高,細(xì)胞因子(IFNγ)與

6、殺傷顆粒(CD107a,Granzyme B)的表達(dá)都明顯升高。重組蛋白可以有效阻斷K562引起的NK細(xì)胞的活化,包括CD69與顆粒酶B的表達(dá)降低,ERK1/2的磷酸化程度也有一定程度的降低。上述結(jié)果證明,CD226分子作為NK細(xì)胞表面活化性受體,其與配體識別的主要位點(diǎn)位于胞外第一個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域ECD1。CD226分子傳遞的活化信號參與NK細(xì)胞與靶細(xì)胞的粘附,細(xì)胞因子分泌以及殺傷等多種免疫學(xué)過程,ERK1/2分子可能參與了CD22

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