NK細胞活化性受體NKp30配體的鑒定與功能研究.pdf

1、自然殺傷細胞(natural killer cells，NK)是天然免疫系統中重要的效應淋巴細胞，在腫瘤免疫監(jiān)視方面發(fā)揮關鍵作用。NK細胞快速殺傷靶細胞無需預先免疫，也沒有MHC限制性，NK細胞的活性依賴其表面組成性表達的抑制性和活化性受體信號的平衡。自然殺傷性受體(natural cytotoxicity receptors，NCRs)是NK細胞重要的活化性受體，其成員之一NKp30表達在所有人NK細胞表面，在NK細胞對抗病毒感染細胞

2、和腫瘤細胞中扮演重要角色。Galectin-3(簡稱Gal-3)是β半乳糖苷結合蛋白家族成員之一，其包含兩個碳水化合物結合區(qū)域，有較強的β半乳糖親合力，能夠被多種形式的腫瘤細胞表達。據報道，它可以直接作為免疫調節(jié)劑去誘導活化的T細胞的凋亡。盡管如此，它對NK細胞的影響還是不十分清楚，為此，構建和篩選了高效表達人NKp30胞外段和人IgGFc段嵌合蛋白的CHO細胞株，并由此獲得有生物活性的可溶性NKp30-Fc蛋白。進一步使用人宮頸癌細胞

3、系，以及宮頸腺癌異種移植的非肥胖性糖尿病和重癥聯合免疫缺陷(NOD-SCID)小鼠模型對Gal-3分子在NKp30介導的NK細胞抗腫瘤效應中的作用進行研究。
　　主要取得了以下結果:
　　1，重組人NK細胞活化性受體NKp30融合蛋白的制備和功能鑒定。
　　我們構建了NKp30受體胞外段融合了人IgG1的Fc段(NKp30-Fc)的表達載體，利用脂質體轉染中國倉鼠卵巢細胞(CHO-K1)的方法進行真核表達，通過G418

4、抗生素加壓篩選成功獲得表達Kp30-Fc蛋白的細胞克隆，進一步通過有限稀釋法獲得高表達Kp30-Fc蛋白的細胞亞克隆。接下來我們采用ELISA方法篩選高分泌可溶性NKp30-Fc蛋白的亞克隆細胞，并收集其細胞無血清培養(yǎng)上清，使用親和層析法進行可溶性NKp30-Fc蛋白的純化.通過Western blotting方法進行純化后鑒定，最終，我們獲得的NKp30-Fc蛋白的純度在90％以上。功能方面，我們通過流式細胞術發(fā)現可溶性NKp30-F

5、c蛋白能夠結合NKp30配體陽性的腫瘤細胞，此外，51Cr同位素釋放實驗也證明了NKp30-Fc蛋白作為拮抗劑能夠削弱NKp30介導的人NK細胞抗腫瘤效應。
　　2，腫瘤細胞分泌的Gal-3作為人NKp30的可溶性抑制配體，在腫瘤逃逸NK細胞攻擊中起重要作用。
　　我們使用重組的人NK細胞活化性受體NKp30融合蛋白（NKp30-Fc）和人宮頸癌模型，發(fā)現可溶性NKp30-Fc能夠免疫沉淀腫瘤細胞來源的Gal-3蛋白，NKp

6、30和Gal-3的相互作用通過表面等離子體共振(surface plasmon resonance簡稱SPR)實驗被進一步證明。我們的研究發(fā)現Gal-3以一種可溶形式被腫瘤細胞分泌，流式細胞術證明了可溶的Gal-3能夠特異的結合NK細胞，進一步生物化學方法也證明了可溶的Gal-3能夠結合NK細胞表面的NKp30分子。功能方面，當Gal-3被加入到NK-92與Hela細胞的共孵育系統時，我們發(fā)現NKp30介導的，而非NKG2D介導的，NK

7、細胞表達CD107a能力和其細胞毒活性被抑制。若將可溶的Gal-3和NKp30-Fc蛋白預先孵育，這個抑制效應則被恢復。此外，51Cr同位素釋放實驗顯示，若Gal-3表達被下調(shGal-3)，將增強Hela細胞對NK細胞殺傷的敏感性，相反，Gal-3過表達(exGal-3)的Hela細胞對于NK細胞的殺傷將變得不敏感。這些體外的實驗結果在shGal-3-HeLa或exGal-3-HeLa異種移植的，NK細胞過繼免疫治療后的NOD-S

8、CID鼠模型中被進一步證明，表明了體內Gal-3能夠強烈對抗人NK細胞抗腫瘤效應。
　　終上所述:通過這里描述的方法制備的重組NKp30-Fc分子有足夠的能力結合NKp30配體陽性的腫瘤細胞，能夠與NKp30受體的天然，膜結合形式競爭。這個工具分子在定義NKp30與其配體的相互作用中具有廣泛應用，同時有助于尋找NKp30受體功能的拮抗劑。此外，我們證明了腫瘤細胞分泌的Gal-3作為NK細胞活化性受體NKp30的可溶抑制性配體，能夠