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文檔簡介
1、研究背景:深靜脈血栓形成(deepveinthrombosis,DVT)是一種嚴重的,具有潛在危險的疾病,如未得到適當治療易發(fā)展為血栓形成后綜合征、股青腫、股白腫甚至發(fā)生肺栓塞而死亡。流行病學研究提示,深靜脈血栓形成年發(fā)病率為1.60%0-1.82%0?;仡櫺匝芯抠Y料報道,靜脈血栓栓塞癥患者有高達5%-23%的死亡率,即使正規(guī)服用抗凝劑的有癥狀患者,死亡率也有1%-2%。而深靜脈血栓形成患者有三分之一發(fā)生血栓形成后綜合征,肺栓塞患者4%
2、-5%發(fā)生肺動脈高壓。此外,深靜脈血栓形成的治療效果又不確切。因此,研究深靜脈血栓形成的病因、發(fā)病機制和治療至關重要。本研究分兩大部分,第一部分探討靜脈血栓形成的病因學,研究亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolatereductase,MTHFR)C677T和蛋氨酸合成酶還原酶(methioninesynthasereductase,MTRR)A66G墓因多態(tài)性與深靜脈血栓形成的關系,試圖發(fā)現國人靜脈血栓形
3、成的易感因子。第二部分為靜脈血栓形成基因治療的體外實驗研究,以腺病毒介導的尿激酶型纖溶酶原激活劑(urokinase-typeplasminogenactivator,uPA)基因轉染人臍靜脈內皮細胞(humanumbilicalveinendotheliocyte,HUVEC),研究轉uPA基因感染人臍靜脈內皮細胞后的蛋白表達以及纖溶活性改變情況,試圖探討uPA基因治療靜脈血栓形成的可行性和可能機制。
第一部分MTHFR
4、C677T和MTRRA66G基因多態(tài)性與深靜脈血栓形成的關系
目的:研究亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolatereductase,MTHFR)基因和蛋氨酸合成酶還原酶(methioninesynthasereductase.MTRR)墓因的多態(tài)性與深靜脈血栓形成的關系,探討深靜脈血栓形成的病因學。
方法:采用病例對照研究,以101例下肢深靜脈血栓形成患者和同期行健康體檢的正常
5、人群120例(對照組)的血白細胞為樣本,應用等位基因序列特異性引物聚合酶鏈反應(polymerasechainreaction-sequencespecificprimer,PCR-SSP)多態(tài)性技術檢測兩組的MTHFR基因第677位點的多態(tài)性和MTRR基因第66位點的多態(tài)性,分別比較每兩組的基因型和等位基因的分布頻率。同時統(tǒng)計下肢深靜脈血栓形成的發(fā)病部位。
結果:MTHFR的677位點CC、CT和TT基因型頻率在疾病組中
6、分別為41.58%、25.74%、32.67%,在對照組中分別為58.33%、23.33%、18.33%,MTHFR的677位TT基因型頻率與對照組的比較差異有顯著性(x2=7.7,P<0.05)。MTRR的66位點AA、AG和GG基因型頻率在疾病組中分別為26.76%、43.66%、29.58%,在對照組中分別為43.57%、44.28%、12.14%,兩組的分布頻率差異無顯著性(P>0.05)。左下肢深靜脈血栓形成的發(fā)病率為83.2
7、%。
結論:MTHFR基因第677位點的TT基因型多態(tài)性可能與DVT的發(fā)病有關。MTRR基因A66G多態(tài)性可能不是DVT的獨立遺傳危險因素。下肢DVT好發(fā)于左下肢。
第二部分腺病毒介導uPA基因轉染人臍靜脈內皮細胞的體外實驗研究
目的:構建含有人uPA基因的重組腺病毒載體,利用重組腺病毒載體介導人uPA基因轉染人臍靜脈內皮細胞,從基因、蛋白水平檢測目的基因uPA的蛋白表達和纖溶活性,探索靜脈血栓
8、形成基因治療的可行性和可能機制。
方法:用PCR將合成的oligo拼接成完整的uPA基因,將合成好的目的基因序列裝入pMD-18T載體,經Xhol和Sall酶切將目的基因uPA克隆到含增強綠色熒光蛋白(Enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)的質粒載體plRES2-EGFP中,并轉化至感受態(tài)細胞DH5α。以plRES2-EGFP質粒為模板,擴增帶attB1和attB2的uPA-IRES2-
9、EGFP片段。采用pAD/CMV/V5-DESTGatewayVector載體系統(tǒng)作為載體,該系統(tǒng)是缺失了E1和E3早期區(qū)的AD5型腺病毒,可容納6~8.5kb的外源基因,外源基因插入到E1區(qū)。以Gateway兩步重組技術重組腺病毒質粒-BP重組系統(tǒng)將目的片段重組到載體pDONR221上,LR重組系統(tǒng)將目的序列重組到腺病毒質粒載體pAD/CMV/V5-DEST上,測序驗證重組質粒的正確性,構建含有人uPA基因的重組腺病毒載體。PacI將
10、重組腺病毒載體質粒線性化后用脂質體lipofectamine2000轉染293A細胞進行包裝并對病毒液進行擴增、純化和滴度測定。HUVEC細胞培養(yǎng)后實驗分3組:ad.uPA轉染組,ad.neg空載體對照組和空白對照組(n=3)。分別以重組腺病毒載體介導的人uPA基因、空載體對照和空白對照轉染HUVEC細胞,觀察轉uPA基因對HUVEC細胞的影響,測定最佳感染復數((multiplicityofinfection,MOI);采用實時熒光定
11、量聚合酶鏈反應(realtimefluorescencequantitativepolymerasechainreaction,FQ-PCR)、免疫印跡(WesternBlot)和酶聯免疫吸附試驗(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)檢測轉uPA基因在HUVEC的蛋白表達;比色法檢測轉uPA基因在HUVEC細胞上清中的的纖溶活性變化。
結果:成功克隆了人uPA基因,并將攜帶EGFP的目
12、的基因uPA克隆至質粒載體pIRES2-EGFP,成功構建了uPAcDNA的質粒載體puPA-IRES2-EGFP,測序結果與Genebank公布的人uPA基因cDNA序列完全一致,同源性為100%,該基因編碼的蛋白為人uPA。成功構建了人uPA基因重組腺病毒載體pAD-ZWM-PLAU,重組腺病毒載體pAD-ZWM-PLAU經Pacl酶切后用Lipofectamine2000能有效轉染293A細胞,包裝成功,獲得了人uPA基因重組腺病
13、毒ad.uPA。經大量擴增、純化后病毒滴度為5.74×101Oifu/ml。本研究制備的人uPA基因重組腺病毒ad.uPA感染HUVEC細胞后最佳MOI=800。以MOI=800感染HUVEC細胞后,FQ-PCR檢測ad.uPA組、ad.neg組和control組三組目的基因2-△△CT分別為15.2422、4.5631和1,顯示陽性感染病毒細胞中目的基因表達量有明顯提高(P<0.01)。WesternBlot檢測結果示ad.uPA侵染
14、病毒的細胞目的蛋白表達量明顯提高,而侵染陰性腺病毒對照組和空白對照組的HUVEC細胞中幾乎沒有檢測到目的蛋白的表達。目的蛋白大小為55kDa。ELISA檢測轉基因HUVEC培養(yǎng)上清uPA含量結果ad.uPA轉基因組,ad.neg空載體組和空白對照組分別為379.4043±2.46ng/L,240.0099±1.16ng/L和256.1024±3.04ng/L,ad.uPA轉基因組uPA蛋白含量明顯高于空載體組和空白對照組(P<0.01)
15、。比色法檢測轉基因HUVEC細胞uPA活性結果ad.uPA轉基因組,空載體組和空白對照組分別為68.3062±0.64IU/106cells/24h,5.18454±0.19IU106cells/24h和5.02994±0.12IU/106cells/24h,ad.uPA轉基因組uPA活性明顯高于各對照組(P<0.01)。
結論;成功構建了EGFP和uPA雙表達重組腺病毒載體pAD-ZWM-PLAU,并于HUVEC成功表達
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