深靜脈血栓形成病因?qū)W及基因治療的初步研究.pdf

1、研究背景：深靜脈血栓形成(deepveinthrombosis,DVT)是一種嚴(yán)重的,具有潛在危險(xiǎn)的疾病,如未得到適當(dāng)治療易發(fā)展為血栓形成后綜合征、股青腫、股白腫甚至發(fā)生肺栓塞而死亡。流行病學(xué)研究提示,深靜脈血栓形成年發(fā)病率為1.60％0-1.82％0?；仡櫺匝芯抠Y料報(bào)道,靜脈血栓栓塞癥患者有高達(dá)5％-23％的死亡率,即使正規(guī)服用抗凝劑的有癥狀患者,死亡率也有1％-2％。而深靜脈血栓形成患者有三分之一發(fā)生血栓形成后綜合征,肺栓塞患者4％

2、-5％發(fā)生肺動(dòng)脈高壓。此外,深靜脈血栓形成的治療效果又不確切。因此,研究深靜脈血栓形成的病因、發(fā)病機(jī)制和治療至關(guān)重要。本研究分兩大部分,第一部分探討靜脈血栓形成的病因?qū)W,研究亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolatereductase,MTHFR)C677T和蛋氨酸合成酶還原酶(methioninesynthasereductase,MTRR)A66G墓因多態(tài)性與深靜脈血栓形成的關(guān)系,試圖發(fā)現(xiàn)國(guó)人靜脈血栓形

3、成的易感因子。第二部分為靜脈血栓形成基因治療的體外實(shí)驗(yàn)研究,以腺病毒介導(dǎo)的尿激酶型纖溶酶原激活劑(urokinase-typeplasminogenactivator,uPA)基因轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(humanumbilicalveinendotheliocyte,HUVEC),研究轉(zhuǎn)uPA基因感染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞后的蛋白表達(dá)以及纖溶活性改變情況,試圖探討uPA基因治療靜脈血栓形成的可行性和可能機(jī)制。
　　 第一部分MTHFR

4、C677T和MTRRA66G基因多態(tài)性與深靜脈血栓形成的關(guān)系
　　 目的：研究亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolatereductase,MTHFR)基因和蛋氨酸合成酶還原酶(methioninesynthasereductase.MTRR)墓因的多態(tài)性與深靜脈血栓形成的關(guān)系,探討深靜脈血栓形成的病因?qū)W。
　　 方法：采用病例對(duì)照研究,以101例下肢深靜脈血栓形成患者和同期行健康體檢的正常

5、人群120例（對(duì)照組）的血白細(xì)胞為樣本,應(yīng)用等位基因序列特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction-sequencespecificprimer,PCR-SSP)多態(tài)性技術(shù)檢測(cè)兩組的MTHFR基因第677位點(diǎn)的多態(tài)性和MTRR基因第66位點(diǎn)的多態(tài)性,分別比較每?jī)山M的基因型和等位基因的分布頻率。同時(shí)統(tǒng)計(jì)下肢深靜脈血栓形成的發(fā)病部位。
　　 結(jié)果：MTHFR的677位點(diǎn)CC、CT和TT基因型頻率在疾病組中

6、分別為41.58％、25.74％、32.67％,在對(duì)照組中分別為58.33％、23.33％、18.33％,MTHFR的677位TT基因型頻率與對(duì)照組的比較差異有顯著性(x2=7.7,P<0.05)。MTRR的66位點(diǎn)AA、AG和GG基因型頻率在疾病組中分別為26.76％、43.66％、29.58％,在對(duì)照組中分別為43.57％、44.28％、12.14％,兩組的分布頻率差異無(wú)顯著性(P>0.05)。左下肢深靜脈血栓形成的發(fā)病率為83.2

7、％。
　　 結(jié)論：MTHFR基因第677位點(diǎn)的TT基因型多態(tài)性可能與DVT的發(fā)病有關(guān)。MTRR基因A66G多態(tài)性可能不是DVT的獨(dú)立遺傳危險(xiǎn)因素。下肢DVT好發(fā)于左下肢。
　　 第二部分腺病毒介導(dǎo)uPA基因轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：構(gòu)建含有人uPA基因的重組腺病毒載體,利用重組腺病毒載體介導(dǎo)人uPA基因轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,從基因、蛋白水平檢測(cè)目的基因uPA的蛋白表達(dá)和纖溶活性,探索靜脈血栓

8、形成基因治療的可行性和可能機(jī)制。
　　 方法：用PCR將合成的oligo拼接成完整的uPA基因,將合成好的目的基因序列裝入pMD-18T載體,經(jīng)Xhol和Sall酶切將目的基因uPA克隆到含增強(qiáng)綠色熒光蛋白(Enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)的質(zhì)粒載體plRES2-EGFP中,并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α。以plRES2-EGFP質(zhì)粒為模板,擴(kuò)增帶attB1和attB2的uPA-IRES2-

9、EGFP片段。采用pAD/CMV/V5-DESTGatewayVector載體系統(tǒng)作為載體,該系統(tǒng)是缺失了E1和E3早期區(qū)的AD5型腺病毒,可容納6～8.5kb的外源基因,外源基因插入到E1區(qū)。以Gateway兩步重組技術(shù)重組腺病毒質(zhì)粒-BP重組系統(tǒng)將目的片段重組到載體pDONR221上,LR重組系統(tǒng)將目的序列重組到腺病毒質(zhì)粒載體pAD/CMV/V5-DEST上,測(cè)序驗(yàn)證重組質(zhì)粒的正確性,構(gòu)建含有人uPA基因的重組腺病毒載體。PacI將

10、重組腺病毒載體質(zhì)粒線性化后用脂質(zhì)體lipofectamine2000轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞進(jìn)行包裝并對(duì)病毒液進(jìn)行擴(kuò)增、純化和滴度測(cè)定。HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)后實(shí)驗(yàn)分3組：ad.uPA轉(zhuǎn)染組,ad.neg空載體對(duì)照組和空白對(duì)照組(n=3)。分別以重組腺病毒載體介導(dǎo)的人uPA基因、空載體對(duì)照和空白對(duì)照轉(zhuǎn)染HUVEC細(xì)胞,觀察轉(zhuǎn)uPA基因?qū)UVEC細(xì)胞的影響,測(cè)定最佳感染復(fù)數(shù)((multiplicityofinfection,MOI)；采用實(shí)時(shí)熒光定

11、量聚合酶鏈反應(yīng)(realtimefluorescencequantitativepolymerasechainreaction,FQ-PCR)、免疫印跡(WesternBlot)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)檢測(cè)轉(zhuǎn)uPA基因在HUVEC的蛋白表達(dá)；比色法檢測(cè)轉(zhuǎn)uPA基因在HUVEC細(xì)胞上清中的的纖溶活性變化。
　　 結(jié)果：成功克隆了人uPA基因,并將攜帶EGFP的目

12、的基因uPA克隆至質(zhì)粒載體pIRES2-EGFP,成功構(gòu)建了uPAcDNA的質(zhì)粒載體puPA-IRES2-EGFP,測(cè)序結(jié)果與Genebank公布的人uPA基因cDNA序列完全一致,同源性為100％,該基因編碼的蛋白為人uPA。成功構(gòu)建了人uPA基因重組腺病毒載體pAD-ZWM-PLAU,重組腺病毒載體pAD-ZWM-PLAU經(jīng)Pacl酶切后用Lipofectamine2000能有效轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞,包裝成功,獲得了人uPA基因重組腺病

13、毒ad.uPA。經(jīng)大量擴(kuò)增、純化后病毒滴度為5.74×101Oifu/ml。本研究制備的人uPA基因重組腺病毒ad.uPA感染HUVEC細(xì)胞后最佳MOI=800。以MOI=800感染HUVEC細(xì)胞后,FQ-PCR檢測(cè)ad.uPA組、ad.neg組和control組三組目的基因2-△△CT分別為15.2422、4.5631和1,顯示陽(yáng)性感染病毒細(xì)胞中目的基因表達(dá)量有明顯提高（P<0.01）。WesternBlot檢測(cè)結(jié)果示ad.uPA侵染

14、病毒的細(xì)胞目的蛋白表達(dá)量明顯提高,而侵染陰性腺病毒對(duì)照組和空白對(duì)照組的HUVEC細(xì)胞中幾乎沒(méi)有檢測(cè)到目的蛋白的表達(dá)。目的蛋白大小為55kDa。ELISA檢測(cè)轉(zhuǎn)基因HUVEC培養(yǎng)上清uPA含量結(jié)果ad.uPA轉(zhuǎn)基因組,ad.neg空載體組和空白對(duì)照組分別為379.4043±2.46ng/L,240.0099±1.16ng/L和256.1024±3.04ng/L,ad.uPA轉(zhuǎn)基因組uPA蛋白含量明顯高于空載體組和空白對(duì)照組(P<0.01)

15、。比色法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因HUVEC細(xì)胞uPA活性結(jié)果ad.uPA轉(zhuǎn)基因組,空載體組和空白對(duì)照組分別為68.3062±0.64IU/106cells/24h,5.18454±0.19IU106cells/24h和5.02994±0.12IU/106cells/24h,ad.uPA轉(zhuǎn)基因組uPA活性明顯高于各對(duì)照組(P<0.01)。
　　 結(jié)論；成功構(gòu)建了EGFP和uPA雙表達(dá)重組腺病毒載體pAD-ZWM-PLAU,并于HUVEC成功表達(dá)