海膜多糖提取、分離純化及其結(jié)構(gòu)分析.pdf

1、海膜(Halymenia sinesis)隸屬于海膜科(Halymeniaceae)紅藻。蜈蚣藻屬海藻與海膜均隸屬于海膜科，但在近幾年的研究結(jié)果表明，蜈蚣藻多糖具有良好的抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、抗凝血和調(diào)節(jié)免疫等作用，具有開發(fā)成藥物的潛在價值。
　　雖然關(guān)于蜈蚣藻屬海藻多糖的研究成果較多，但目前，未有對海膜多糖的提取工藝及分離純化的學(xué)術(shù)論文，后期的結(jié)構(gòu)分析及藥理活性也未進(jìn)行詳細(xì)的研究。本論文以采自浙江舟山枸杞島的海膜藻為原料，對海

2、膜多糖的提取工藝、分離純化和結(jié)構(gòu)分析進(jìn)行研究。
　　本文包括三個部分，即超聲波輔助提取海膜多糖的工藝參數(shù)優(yōu)化、海膜粗多糖的分離純化、海膜均一多糖的結(jié)構(gòu)分析。研究工作及主要成果如下：
　　第一部分：超聲波輔助提取海膜多糖的提取工藝優(yōu)化。
　　1、水浴提取工藝單因素試驗：采用熱水提取海膜多糖，通過單因素試驗研究水浴提取時間和提取溫度對海膜多糖提取率的影響，確定了最佳水浴提取工藝參數(shù)為提取時間4 h，提取溫度90℃，此時多糖

3、提取率最大。
　　2、超聲波輔助提取工藝試驗：采用超聲波輔助提取海膜多糖，進(jìn)一步優(yōu)化海膜多糖提取工藝。通過單因素試驗和L9(33)正交試驗研究超聲功率、超聲時間和料液質(zhì)量濃度對多糖提取率的影響。確定了最佳超聲波輔助提取工藝參數(shù)為料液質(zhì)量濃度0.020 g/mL、超聲時間60min、超聲功率400W，此時提取率最大，多糖提取率為36.91％，總糖含量為63.85%。通過對正交試驗結(jié)果分析得料液質(zhì)量濃度是影響多糖提取率的主要因素，對多

4、糖提取具有顯著影響，其次是超聲時間，再次是超聲功率。
　　第二部分：海膜粗多糖的分離純化。
　　1、利用陰離子交換色譜柱Q-FF(Q-Sepharose Fast Flow)法對超聲波輔助提取獲得的海膜多糖HSPS進(jìn)行初步分離純化，確定多糖主要洗脫成分為蒸餾水、1.0mol/LNaCl、1.5mol/LNaCl、0.2mol/LNaOH，其分子質(zhì)量分別為1.35×105Da、4.81×104 Da、5.33×104 Da、9

5、.47×104 Da。
　　2、利用Superdex-200葡聚糖凝膠過濾層析法對Q-FF獲得的4種多糖進(jìn)行二次純化，獲得6種分子量相近，極性相同的均一多糖組分：HSPS1-Ⅰ、HSPS2-Ⅱ、HSPS3-Ⅰ、HSPS3-Ⅱ、HSPS4-Ⅰ、HSPS4-Ⅱ。經(jīng)HPLC檢測為單一對稱峰，說明6種海膜多糖組分為均一多糖，分子量相近，極性相同，其相對分子量分別為4.31×105 Da、5.62×104 Da、1.29×105 Da、8.

6、20×104 Da、3.70×105 Da、1.77×105 Da。
　　第三部分：海膜均一多糖的結(jié)構(gòu)鑒定
　　1、采用酸水解法結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)測定海膜多糖單糖組成。選取每種洗脫濃度成分中的一種，即HSPS1-Ⅰ、HSPS2-Ⅱ、HSPS3-Ⅰ和HSPS4-Ⅰ，酸水解后分別用GC-MS檢測，結(jié)果表明4種多糖的單糖組成較為簡單，均為2種，分別為半乳糖和葡萄糖，半乳糖摩爾含量在95%左右。從而證明了海膜多糖主鏈

7、是由半乳聚糖組成。
　　2、采用紅外光譜(IR)鑒定海膜多糖構(gòu)型。結(jié)果表明5種多糖在3600-3200 cm-1處出現(xiàn)一寬峰，說明存在多糖分子中分子間或分子內(nèi)O-H的伸縮振動；在2930 cm-1附近出現(xiàn)吸收峰，說明是烷基中C-H的伸縮振動，由海膜多糖存在這2種特征吸收峰可以證明該類化合物為糖類化合物。5種多糖在1730 cm-1左右有吸收峰說明有糖醛酸存在；1730-1600 cm-1處有吸收峰，證明多糖存在-COO-的C=O鍵

8、伸縮振動或多糖中含有少量結(jié)晶水；在1416 cm-1處有-COOH中C-O的吸收峰；1246 cm-1處有強(qiáng)吸收峰，為磺酸基中S=O的伸縮振動。5種多糖在1100-1010 cm-1處均有3個強(qiáng)吸收峰，說明均含有吡喃糖苷鍵，含有C-O-C特征骨架；在844±8 cm-1處有吸收峰說明多糖均含有α-糖苷鍵。
　　3、一維、二維核磁共振(1D、2D NMR)分析其糖殘基類型、連接順序及取代位點。通過1H NMR分析發(fā)現(xiàn)，5種多糖異頭碳

9、上氫的化學(xué)位移δ為4.30-4.60ppm和5.05-5.60ppm范圍內(nèi)，表明多糖含有α-型和β-型2類糖苷鍵，并在1.35-1.45ppm為有丙酮酸。通過13C NMR分析發(fā)現(xiàn)，5種多糖異頭碳的化學(xué)位移在δ95-100ppm和δ100-105ppm范圍內(nèi)，表明多糖含有α-型和β-型2類糖苷鍵；由于多糖的信號大多數(shù)集中在δ60-85ppm的范圍內(nèi)，可以判斷該多糖為吡喃環(huán)。5種多糖在δ75-85ppm，有明顯的信號，因此可以判斷多糖在C

10、2，C3，C4發(fā)生取代；在低場δ176.5-177.7ppm處有丙酮酸C1的信號，在δ101.98ppm有C2的信號，初步判斷多糖含有 pG糖苷鍵。通過 DEPT NMR發(fā)現(xiàn)在δ61-63ppm，δ65.6-66.8ppm，δ68-69.5ppm處有信號，可以判定C6發(fā)生取代。通過H-H COSY及HSQC NMR分析發(fā)現(xiàn)，HSPS1-Ⅰ含有GP→LA2M、GP→L、G2S→LA2M、G2S→D和G2S→LA連接；HSPS2-Ⅱ含有 G