皮內(nèi)注射用布氏菌活疫苗的評(píng)價(jià).pdf

1、布氏菌病（Brucellosis，簡稱布?。┦歉腥静剪斁蠖鸬哪軌蛟谌撕蛣?dòng)物中傳播的一類人獸共患病?？赏ㄟ^口腔粘膜、鼻腔、眼結(jié)膜、生殖道、甚至未損傷的皮膚而感染。家畜感染后如果得不到良好的治療可引流產(chǎn)和不育，人感染后主要引起波浪熱或者轉(zhuǎn)化為慢性感染。據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)查，全球已有170多個(gè)國家和地區(qū)有布病發(fā)生和流行。而我國28個(gè)省市區(qū)的人、畜有布病存在和流行，每年造成近千萬元損失。到目前為止，疫苗接種是防治布病最有效、最經(jīng)濟(jì)的手段。布

2、氏疫苗主要包括滅活苗、弱毒活疫苗、菌體組分疫苗以及現(xiàn)在熱門研究的DNA疫苗和重組蛋白疫苗等。目前，我國預(yù)防布病采用的人用布氏菌活疫苗為牛種弱毒株104M菌株，接種方式為皮上劃痕。該方法操作復(fù)雜、不能定量接種，人群接種陽轉(zhuǎn)率低，保護(hù)效果有限，被接種者因劃痕產(chǎn)生疼痛而不易被接受，從而影響疫苗的廣泛使用。鑒于布病疫情控制的需要，我們采用具有經(jīng)濟(jì)性好和安全性高的皮內(nèi)注射接種方式替代傳統(tǒng)的皮上劃痕。本次研究以小鼠和豚鼠動(dòng)物模型，采用皮內(nèi)注射方式免

3、疫途徑，通過體液免疫應(yīng)答、細(xì)胞免疫應(yīng)答和保護(hù)力試驗(yàn)三個(gè)方面的結(jié)果全面評(píng)價(jià)疫苗的免疫原性和保護(hù)力。
　　一、小鼠模型中皮內(nèi)注射布氏菌活疫苗免疫原性評(píng)價(jià)
　　以小鼠為動(dòng)物模型，皮內(nèi)免疫布氏菌活疫苗初步評(píng)價(jià)其免疫原性。后肢外側(cè)皮內(nèi)注射免疫小鼠，免疫4周后，摘眼球采血，分離血清，用于ELISA檢測血清中Br-PPD蛋白特異性IgG水平，同時(shí)無菌取動(dòng)物脾臟，無菌分離小鼠脾淋巴細(xì)胞，進(jìn)行特異性抗原的IFN-γ和IL-4 ELISPOT檢

4、測;用ELISA方法檢測體外再刺激后小鼠脾細(xì)胞分泌細(xì)胞因子水平;流式細(xì)胞術(shù)對(duì)T細(xì)胞亞群進(jìn)行分類。結(jié)果表明，免疫組小鼠血清中PPD和菌體抗原特異性IgG水平、特異性IFN-γ、IL-4細(xì)胞數(shù)量均高于對(duì)照組;流式結(jié)果顯示，免疫組小鼠CD4-IFN-γ+和CD4+IL-4+細(xì)胞明高于陰性組;結(jié)果表明在小鼠模型中，采用皮內(nèi)注射方式免疫小鼠，誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答，有很好的免疫原性。
　　二、豚鼠模型中皮內(nèi)注射布氏菌活疫苗

5、免疫原性評(píng)價(jià)
　　以豚鼠為動(dòng)物模型，皮內(nèi)免疫布氏菌活疫苗初步評(píng)價(jià)其免疫原性。對(duì)SPF級(jí)Hartly豚鼠后肢外側(cè)皮內(nèi)注射，以及用劃痕接種方式做對(duì)照，免疫4周后，心臟采血，并分離血清，用于ELISA檢測血清中Br-PPD蛋白抗原特異性IgG水平，同時(shí)暴露豚鼠背部皮膚，除毛，皮內(nèi)注射PPD變態(tài)反應(yīng)原，注射劑量均為30μg/只。免疫24 h和48 h后分別觀察注射部位出現(xiàn)紅腫反應(yīng)，并測量平均硬結(jié)反應(yīng)直徑，以縱、橫直徑相加平均數(shù)不小于5 m

6、m作為陽性標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算陽性反應(yīng)率。抗體效價(jià)結(jié)果顯示，免疫組小鼠血清中Br-PPD抗原特異性IgG水平高于對(duì)照組;皮膚試驗(yàn)結(jié)果(DTH)結(jié)果顯示，免疫組動(dòng)物對(duì)PPD抗原24h及48h的DTH陽轉(zhuǎn)率均為100％。結(jié)果表明在豚鼠模型中，皮內(nèi)注射免疫途徑可行，免后誘導(dǎo)豚鼠產(chǎn)生較高的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答。
　　三、小鼠模型中皮內(nèi)注射布氏活菌疫苗對(duì)羊種弱毒株保護(hù)力評(píng)價(jià)
　　以小鼠為動(dòng)物模型，皮下攻擊羊布氏菌M5弱毒株，以脾臟中攻擊菌菌荷

7、量為保護(hù)力評(píng)價(jià)指標(biāo)。0周皮內(nèi)注射免疫布氏菌活疫苗，免疫4周后，對(duì)每只小鼠后肢皮下攻擊羊種布氏菌M5弱毒株，劑量為5×108CFU/只，攻擊4周后，無菌條件下解剖小鼠，取其脾臟，放入研磨器中研磨，接種加入含1∶10萬硫堇染料的TSA平皿培養(yǎng)基中培養(yǎng)，免疫組小鼠脾臟荷菌量與陰性組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。試驗(yàn)表明皮內(nèi)注射方式免疫小鼠，使得小鼠獲得很好的免疫保護(hù)力。
　　四、豚鼠模型中皮內(nèi)注射布氏活菌疫苗對(duì)羊種弱毒株保護(hù)力評(píng)價(jià)
　　以

8、豚鼠為動(dòng)物模型，用羊布氏菌M5弱毒株皮下攻擊，以脾臟菌載量為保護(hù)力評(píng)價(jià)指標(biāo)。0周皮內(nèi)注射免疫布氏菌活疫苗，免疫4周后，對(duì)每只豚鼠后肢皮下攻擊羊種布氏菌M5弱毒株，劑量為5×108CFU/只，攻擊3周后，無菌條件下解剖豚鼠，取其脾臟，放入研磨器中研磨，接種加入含1∶10萬硫堇染料的TSA平皿培養(yǎng)基中培養(yǎng)，通過脾臟荷菌數(shù)評(píng)價(jià)布氏活苗的免疫保護(hù)作用。結(jié)果顯示，免疫組小鼠脾臟沒有分離到感染菌，陰性組分離出大量的布氏菌。試驗(yàn)表明皮內(nèi)注射方式免疫豚

9、鼠，使得豚鼠獲得很好的免疫保護(hù)力。
　　五、小鼠模型中皮內(nèi)注射布氏菌活疫苗對(duì)羊種強(qiáng)毒株保護(hù)力評(píng)價(jià)
　　以小鼠為動(dòng)物模型，用羊布氏菌16M強(qiáng)毒株皮下攻擊，以脾臟中攻擊用布氏菌載量為保護(hù)力評(píng)價(jià)指標(biāo)。0周皮內(nèi)注射免疫布氏菌活疫苗，免疫4周后，后肢皮下攻擊羊種布氏菌16M強(qiáng)毒株，劑量為5×106CF U/只，攻擊4周后，無菌條件下解剖小鼠，取其脾臟，放入研磨器中研磨，接種加入含1∶10萬硫堇染料的TSA平皿培養(yǎng)基中培養(yǎng)。免疫組小鼠脾