布氏菌活疫苗滴鼻免疫效應(yīng)評(píng)價(jià)研究.pdf

1、布氏菌?。˙rucellosis，布?。┦且活愑刹际暇鸬某Ｒ娙诵蠊不紓魅静?。據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)查，全球已有170多個(gè)國(guó)家和地區(qū)有布病發(fā)生和流行。由于長(zhǎng)期使用抗生素治療布病會(huì)造成細(xì)菌耐藥，所以接種疫苗是預(yù)防布病最實(shí)際、最有效的措施。當(dāng)前我國(guó)預(yù)防布病使用的牛種弱毒株104M菌株是國(guó)內(nèi)現(xiàn)有唯一人用布氏疫苗，接種方式為皮上劃痕。但皮上劃痕接種有諸多弊端，包括難以確定有效接種量、接種復(fù)雜、皮膚遺留疤痕、皮膚疼痛以及伴有其他異常反應(yīng)等。因此改善疫

2、苗的接種方法對(duì)于有效預(yù)防布病十分必要。粘膜是機(jī)體抵抗外來感染的主要屏障，經(jīng)滴鼻免疫后可以在系統(tǒng)和粘膜內(nèi)產(chǎn)生針對(duì)抗原的特異性免疫反應(yīng)。滴鼻疫苗具有安全性好，接種簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，且誘發(fā)的系統(tǒng)免疫有較好的交叉免疫保護(hù)效果。因此，本研究用滴鼻免疫的方式代替?zhèn)鹘y(tǒng)落后的皮上劃痕接種方式，分別以小鼠和豚鼠為動(dòng)物模型，通過體液免疫、粘膜免疫、細(xì)胞免疫應(yīng)答以及主、被動(dòng)免疫保護(hù)力試驗(yàn)結(jié)果全面評(píng)價(jià)疫苗的免疫原性和保護(hù)力。凍干保護(hù)劑直接與疫苗凍干后的活菌率和穩(wěn)定性

3、相關(guān)聯(lián)，故本文也對(duì)布氏疫苗的制備進(jìn)行了研究，主要討論凍干保護(hù)劑中明膠濃度對(duì)布氏菌活疫苗活菌率的影響，為布氏疫苗保護(hù)劑中最佳明膠濃度的確定提供理論依據(jù)。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴將布氏桿菌104M株菌種接種到代肝瓊脂培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)種，擴(kuò)大培養(yǎng)，用含明膠濃度分別為0％、0.25%、0.5%、1%的4種保護(hù)劑收獲。經(jīng)濃度測(cè)定，調(diào)配濃度，冷凍干燥，封口等步驟，制備1000億/mL和5億/mL兩種濃度的布氏菌活疫苗，測(cè)定凍干后布氏疫苗的活菌數(shù)

4、。4 oC保存樣品凍干封口后2天、2周、1個(gè)月、3個(gè)月測(cè)定活菌數(shù)。37 oC保存樣品凍干封口后2周、1個(gè)月測(cè)定活菌數(shù)。結(jié)果表明，凍干保護(hù)劑中明膠的濃度愈高，布氏疫苗的活菌率愈低，且穩(wěn)定性越差。⑵以小鼠為動(dòng)物模型，滴鼻免疫布氏菌活疫苗，觀察其免疫應(yīng)答效果。免疫4周后，對(duì)小鼠進(jìn)行摘眼球采血及制備血清，制備脾淋巴細(xì)胞以及肺鼻灌洗液。間接ELISA法檢測(cè)血清中Br-PPD蛋白特異性IgG抗體水平，肺鼻灌洗液中Br-PPD蛋白特異性IgG、IgA

5、抗體水平及體外再刺激后小鼠脾細(xì)胞分泌IFN-γ、IL-4水平；ELISPOT法檢測(cè)分泌IFN-γ、IL-4的脾臟細(xì)胞數(shù)目；流式細(xì)胞術(shù)對(duì)T細(xì)胞內(nèi)IFN-γ、IL-4細(xì)胞因子染色檢測(cè)。結(jié)果顯示，免疫組小鼠血清中IgG抗體水平，肺鼻灌洗液中IgG、IgA抗體水平均明顯高于對(duì)照組；分泌IFN-γ的脾臟淋巴細(xì)胞數(shù)，體外再刺激后小鼠脾細(xì)胞分泌IFN-γ的水平及脾淋巴細(xì)胞中CD4+IFN-γ+細(xì)胞比例均明顯高于陰性對(duì)照組。結(jié)果表明，在小鼠模型中，滴鼻

6、免疫途徑可行，免疫后誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高的體液免疫、細(xì)胞免疫和粘膜免疫應(yīng)答。⑶以豚鼠為動(dòng)物模型，滴鼻免疫布氏菌活疫苗，觀察其免疫應(yīng)答效果。免疫4周后，對(duì)豚鼠進(jìn)行心臟采血及制備血清（保存部分血清用于血清被動(dòng)保護(hù)力試驗(yàn)），制備肺泡灌洗液以及鼻腔灌洗液。間接ELISA法檢測(cè)豚鼠血清中Br-PPD蛋白特異性IgG抗體水平，肺鼻灌洗液中Br-PPD蛋白特異性IgG、IgA抗體水平。采血3天后，皮內(nèi)注射PPD變態(tài)反應(yīng)原，注射24 h后觀察注射部位出現(xiàn)紅

7、腫反應(yīng)，并測(cè)量平均硬結(jié)反應(yīng)直徑，以縱、橫直徑相加平均數(shù)不小于5 mm作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算陽(yáng)性反應(yīng)率。結(jié)果顯示，免疫組豚鼠血清IgG抗體水平，肺鼻灌洗液中IgG、IgA抗體水平均明顯高于對(duì)照組；免疫組動(dòng)物對(duì)PPD抗原24 h后的DTH陽(yáng)轉(zhuǎn)率均為100%。結(jié)果表明在豚鼠模型中，滴鼻免疫途徑可行，免疫后誘導(dǎo)豚鼠產(chǎn)生較高的體液免疫、細(xì)胞免疫和粘膜免疫應(yīng)答。⑷以小鼠為動(dòng)物模型，滴鼻免疫布氏菌活疫苗，免疫4周后，對(duì)小鼠以滴鼻和皮下兩種途徑攻擊羊種布氏

8、菌M5弱毒株；滴鼻攻擊羊種布氏菌XJ91-60強(qiáng)毒株、國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)菌株(羊種55210株、豬種55213株、犬種55226株)、國(guó)內(nèi)強(qiáng)毒布氏菌株（豬種8506株、犬種D042株）。攻擊4周后，無菌條件下解剖小鼠，取其脾臟，放入研磨器中研磨，接種含1：10萬硫堇染料的TSA平皿培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以脾臟菌荷量為保護(hù)力評(píng)價(jià)指標(biāo)。結(jié)果顯示，免疫組小鼠脾臟沒有分離到感染菌，陰性組分離出大量的布氏菌。試驗(yàn)表明滴鼻免疫途徑可行，使得小鼠獲得很好的免疫保護(hù)力。

9、⑸以豚鼠為動(dòng)物模型，滴鼻免疫布氏菌活疫苗，免疫4周后，對(duì)豚鼠以滴鼻和皮下兩種途徑攻擊羊種布氏菌M5弱毒株，劑量為5×108CFU/只。攻擊3周后，無菌條件下解剖豚鼠，取其脾臟，放入研磨器中研磨，接種含1：10萬硫堇染料的TSA平皿培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以脾臟菌荷量為保護(hù)力評(píng)價(jià)指標(biāo)。結(jié)果顯示，免疫組豚鼠脾臟荷菌量與陰性組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。試驗(yàn)表明滴鼻免疫途徑可行，使得豚鼠獲得很好的免疫保護(hù)力。⑹以小鼠為模型，進(jìn)行豚鼠血清被動(dòng)保護(hù)力試驗(yàn)。將原倍

10、豚鼠血清、10倍稀釋豚鼠血清、100倍稀釋豚鼠血清對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射，用羊布氏菌M5弱毒株對(duì)所有小鼠進(jìn)行后肢皮下攻擊，劑量為1×108CFU/只。攻擊4周后，無菌條件下解剖小鼠，取其脾臟，放入研磨器中研磨，接種TSA平皿培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以脾臟菌荷量為保護(hù)力評(píng)價(jià)指標(biāo)。結(jié)果顯示，原倍豚鼠血清、10倍稀釋豚鼠血清注射組小鼠脾臟荷菌量與陰性組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明經(jīng)滴鼻免疫的豚鼠血清對(duì)小鼠羊布氏菌M5菌攻擊有較好的被動(dòng)保護(hù)效果，同時(shí)也說明布氏