食管內(nèi)環(huán)外縱平滑肌層的構(gòu)建及其體內(nèi)培育.pdf

1、目的：根據(jù)天然食道肌層內(nèi)環(huán)外縱的雙層結(jié)構(gòu)，制備出一種具有雙面微槽構(gòu)造的生物降解性的聚氨酯(PU)支架，作為食道肌層損傷修復(fù)的替代物，引導(dǎo)食道外縱肌和內(nèi)環(huán)肌的再生，并在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行肌層的在體培育，為食道疾病的治療提供了基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：通過組織塊貼壁的方法，從新西蘭大白兔食道中提取并培養(yǎng)原代平滑肌細(xì)胞(SMCs)，作為實(shí)驗(yàn)用種子細(xì)胞。同時(shí)，課題組自制了帶有兩種微槽構(gòu)造的硅材質(zhì)模具，微槽構(gòu)造分別為：具有連續(xù)凹槽的圖案(P1)

2、，槽寬200 um，槽深30 um，槽間距30 um；和具有不連續(xù)凹槽圖案(P2)，槽寬100 um，槽深30 um，間隔30 um，間隔前后間距30 um，間隔長(zhǎng)150 um，以無圖案的PU支架(P3)作為對(duì)照。將醫(yī)用的生物可降解的PU材料溶于1,4-二氧六環(huán)溶液中，得到PU溶液，倒在用上述自制模具制備的子模具(PDMS)上，制備了兩種上述 P1和P2圖案的支架 PU1和PU2。通過對(duì)制備的PU支架進(jìn)行絲素蛋白(SF)的接枝得到PU1

3、-SF和PU2-SF，提高其表面的親水性能，進(jìn)一步提高其生物相容性。將上述原代 SMCs種植于改性前后的支架上，檢測(cè) SMC在其上的生長(zhǎng)特性，利用四甲基偶氮唑鹽(MTT)檢測(cè)細(xì)胞在支架上生長(zhǎng)率，利用細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)和掃描電鏡(SEM)檢測(cè)支架表面細(xì)胞的生長(zhǎng)形態(tài)及鑒定細(xì)胞類型，利用蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)支架上平滑肌細(xì)胞的表達(dá)肌動(dòng)蛋白的能力，通過上述幾種方法來探索制備的PU支架對(duì) SMCs具有良好的細(xì)胞相容性和細(xì)胞生長(zhǎng)的方向性誘導(dǎo)作用，細(xì)胞在 P

4、U2-SF上的生長(zhǎng)率優(yōu)于PU1-SF，并且更能保持平滑肌的形態(tài)。為了在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)再生組織中血管的生長(zhǎng)，根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用對(duì)上述改性后支架接枝血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的方法。另外，為緩解支架成管后內(nèi)面的機(jī)械張力，將點(diǎn)斷的PU2作為管子內(nèi)層，而連續(xù) PU1作為管子外層，用1,4-二氧六環(huán)將二層支架以微槽垂直取向黏合成具有雙面微槽的復(fù)合支架。建立動(dòng)物食管肌層缺損模型，將制備的支架植入損傷處，進(jìn)行體內(nèi)原位替代實(shí)驗(yàn)，包括片狀支架替代和

5、環(huán)狀支架整環(huán)替代，以觀察并培養(yǎng)食道外縱肌和內(nèi)環(huán)肌的生長(zhǎng)，H&E染色檢測(cè)支架對(duì)損傷面的修復(fù)和再生作用。
　　結(jié)果：在體外通過組織塊貼壁法成功獲取了原代平滑肌細(xì)胞，傳至多代后仍能保持良好的平滑肌形態(tài)，實(shí)驗(yàn)用到的細(xì)胞為2~4代。制備了兩種微槽構(gòu)造的復(fù)合支架，通過對(duì)細(xì)胞-支架的體外復(fù)合培養(yǎng)及檢測(cè)，證明絲素蛋白改性后能促進(jìn)支架上細(xì)胞的生長(zhǎng)，細(xì)胞也能沿著支架紋路的方向取向，這對(duì)平滑肌細(xì)胞維持其生物功能非常重要。體內(nèi)原位替代結(jié)果顯示，制備的支架