烏拉爾圖小麥醇溶蛋白基因的組成及位點(diǎn)分析.pdf

1、小麥?zhǔn)俏覈?guó)主要的糧食作物之一，其品質(zhì)受到人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注。醇溶蛋白約占種子儲(chǔ)藏蛋白總量的50％~60%，對(duì)面團(tuán)的延展性起著重要的作用，從而影響小麥的加工品質(zhì)。由于醇溶蛋白基因是多基因家族，其基因拷貝數(shù)多、序列相似性高，再加上小麥基因組的龐大，對(duì)于小麥品種中醇溶蛋白基因的數(shù)目及表達(dá)模式很難確定。本研究采用已有基因組框架圖序列的烏拉爾圖小麥PI428198（G1812）為研究材料，分別從DNA、RNA和蛋白質(zhì)三個(gè)不同的方面對(duì)醇溶蛋白基因家

2、族進(jìn)行了系統(tǒng)研究。主要結(jié)果如下：
　　以G1812不同生長(zhǎng)時(shí)期的幼嫩葉片DNA和開(kāi)花后5 d、10 d、15 d、20 d、25 d種子cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共克隆得到28個(gè)醇溶蛋白基因，包括23個(gè)α-、3個(gè)γ-和2個(gè)ω-醇溶蛋白基因，其中從G1812基因組中預(yù)測(cè)出的9個(gè)醇溶蛋白基因均在PCR克隆的方法中得到。利用RNA-Seq對(duì)這28個(gè)醇溶蛋白基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析，其中具有完整ORF的16個(gè)基因的表達(dá)模式基本一致，即在

3、花后5 d的種子和10d的旗葉中表達(dá)量很低，從5DPA到10DPA表達(dá)量迅速上升，在15DPA達(dá)到最大，然后在20DPA到25DPA開(kāi)始逐步下降。為了驗(yàn)證16個(gè)表達(dá)基因是否具有蛋白產(chǎn)物以及這些蛋白產(chǎn)物的特點(diǎn)，利用雙向電泳（2-DE）和MALDI-TOF/TOF-MS對(duì)G1812種子中醇溶蛋白進(jìn)行分析，通過(guò)2-DE發(fā)現(xiàn)16個(gè)表達(dá)量相對(duì)較高的蛋白點(diǎn)，包括12個(gè)醇溶蛋白、3個(gè)低分子量麥谷蛋白和1個(gè)Avenin-3蛋白，并且12個(gè)醇溶蛋白點(diǎn)都能

4、從本文所克隆的28個(gè)基因中找到相匹配的基因。通過(guò)進(jìn)化樹(shù)分析，所有的醇溶蛋白基因均能在四倍體或六倍體小麥中找到同源序列，也進(jìn)一步證明T.urartu是A基因組的供體。
　　利用從醇溶蛋白基因保守區(qū)段設(shè)計(jì)的3對(duì)保守引物，篩選了G1812的BAC文庫(kù)，獲得了128個(gè)包含α-醇溶蛋白基因的陽(yáng)性單克隆，13個(gè)ω-醇溶蛋白基因的陽(yáng)性單克隆和一個(gè)γ-醇溶蛋白基因的陽(yáng)性單克隆。經(jīng)過(guò)限制性內(nèi)切酶圖譜和 BAC末端序列的分析選出24個(gè)陽(yáng)性單克隆利用三

5、代測(cè)序技術(shù)進(jìn)行測(cè)序，獲得長(zhǎng)度超過(guò)100kb的Contig8個(gè)。Contig_1471_1455_1454序列中有24個(gè)ORF，10個(gè)能找到有功能注釋的蛋白，其中有2個(gè)屬于Omega-gliadin蛋白。Omega-2-gliadin是完整基因，但是與Gli-27和Gli-28所推導(dǎo)的氨基酸序列差異較大，并且該 Contig序列中有一個(gè)長(zhǎng)約23.6kb的復(fù)制區(qū)域。Contig_1_1484_1485_1486_1487_2序列中含有25個(gè)