小麥過(guò)敏原α-醇溶蛋白編碼基因的分子克隆的研究.pdf

1、小麥被聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO，1995)認(rèn)定為八大類食物過(guò)敏原之一，小麥過(guò)敏是一個(gè)不可忽視的食品安全問(wèn)題，它多見(jiàn)于遲發(fā)性過(guò)敏反應(yīng)，有較高的病患率和漏診率，且并發(fā)癥狀比較多，嚴(yán)重影響著過(guò)敏患者的生活。隨著我國(guó)加入WTO和國(guó)際上對(duì)食品安全要求的不斷提高，在國(guó)際貿(mào)易中涉及的小麥過(guò)敏問(wèn)題將給我國(guó)的面制品的生產(chǎn)發(fā)展帶來(lái)嚴(yán)重的挑戰(zhàn)。因此，在我國(guó)開(kāi)展小麥過(guò)敏的研究具有重要的價(jià)值。 小麥醇溶蛋白(gliadin)是乳糜瀉的主要致病抗原，醇

2、溶蛋白以多肽單鏈的形式存在，富含谷胺酰胺和脯氨酸，有α、β、γ、ω四個(gè)片段，這些蛋白的毒性已被肯定，對(duì)粘膜損害較大，其中以α片段為最甚。盡管提取小麥醇溶蛋白并不困難，但要從大量高度同源的這類蛋白混合物中提純某種單個(gè)的蛋白卻并非易事，而通過(guò)體外大量表達(dá)則可以解決這個(gè)問(wèn)題。 本研究的主要內(nèi)容包括小麥過(guò)敏原α-gliadin基因的克隆及序列分析、α-gliadin的基因在原核系統(tǒng)中的表達(dá)、α-gliadin的B細(xì)胞抗原表位的預(yù)測(cè)。主要

3、工作如下： 1以小麥品種(鄭麥9023)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，成功地提取了基因組DNA。通過(guò)TA克隆構(gòu)建了克隆載體pMD19-T-α-gli，通過(guò)抗性及藍(lán)白斑篩選，獲得了陽(yáng)性克隆子。陽(yáng)性克隆子經(jīng)過(guò)原位PCR、酶切及測(cè)序鑒定，結(jié)果表明含目的基因，證明載體構(gòu)建正確?？寺〕龅哪康幕虻耐葱詸z索分析表明，成功地克隆到正確的α-gliadin基因序列。 2成功地構(gòu)建了表達(dá)載體pGEX-4T-1-α-gli，并將其轉(zhuǎn)化到受體菌E.coliB

4、L21(DE3)pLysS中，PCR擴(kuò)增和酶切分析顯示構(gòu)建正確。測(cè)序結(jié)果，表明插入片段大小、序列、位置、方向均正確。采用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，通過(guò)SDS-PAGE電泳檢測(cè)，獲得大小約為57kD的表達(dá)蛋白帶，與理論估計(jì)值相符。采用1.0mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)7h時(shí)后，融合蛋白含量GST-α-gliadin達(dá)到菌體總蛋白33.6％左右。 3采用生物信息軟件和互聯(lián)網(wǎng)服務(wù)器，預(yù)測(cè)了α-gliadin的二級(jí)結(jié)構(gòu)和α-gliadin表面