烏拉爾甘草cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及EST分析.pdf

1、甘草為我國(guó)常用大宗藥材，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、保健、食品等領(lǐng)域，年需求量巨大。目前，野生資源日趨減少，人工栽培藥材已經(jīng)成為甘草藥材的主要來(lái)源，但是由于栽培技術(shù)、種質(zhì)混雜等多種因素的影響導(dǎo)致栽培藥材質(zhì)量參差不齊，提高并穩(wěn)定甘草藥材質(zhì)量成為了亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。 基因是影響藥材質(zhì)量的內(nèi)在因素，在基因水平上調(diào)控甘草藥材的質(zhì)量是目前研究的熱點(diǎn)。對(duì)甘草功能基因組的研究能夠從分子水平上揭示甘草有效成分合成及積累的相關(guān)機(jī)制，為甘草藥材質(zhì)量的人工調(diào)

2、控奠定基礎(chǔ)。構(gòu)建cDNA文庫(kù)的是基因篩選和研究的基礎(chǔ)，為基因的篩選提供了了研究平臺(tái)，能夠更加快速而有效的獲得特征基因，對(duì)基因的功能表達(dá)、質(zhì)量形成機(jī)制的研究具有重要的意義。 本文以烏拉爾甘草為材料，應(yīng)用分子生物學(xué)、生物信息學(xué)、植物生理學(xué)等學(xué)科的方法，構(gòu)建了烏拉爾甘草根部組織的cDNA文庫(kù)，并對(duì)文庫(kù)進(jìn)行了EST分析和全長(zhǎng)基因分析，對(duì)甘草基因特征進(jìn)行了初步探討。主要研究結(jié)果如下： (1)建立了甘草RNA提取方法和cDNA合成方

3、法以烏拉爾甘草根組織和葉組織為材料，應(yīng)用LiCl沉淀法提取甘草總RNA，應(yīng)用置換合成法合成雙鏈cDNA。電泳檢測(cè)條帶清晰完整，紫外檢測(cè)純度符合要求，cDNA smear條帶范圍在0.1 kb～6kb之間，合成的cDNA片段較長(zhǎng)。 (2)構(gòu)建了烏拉爾甘草根組織cDNA文庫(kù)以烏拉爾甘草根組織為材料，構(gòu)建了甘草的cDNA文庫(kù)，經(jīng)測(cè)定原始文庫(kù)的庫(kù)容量為1.15×10<'7>，重組率為98.2％，擴(kuò)增后文庫(kù)庫(kù)容量達(dá)到1.41×10<'9>

4、，重組率為95.3％，插入片段多分布在0.5～4.8kb之間，絕大部分在1.0～2.5kb之間。 (3)分析了甘草EST序列的特征以烏拉爾甘草根組織cDNA文庫(kù)為材料，應(yīng)用隨機(jī)測(cè)序分析的方法共得到126條EST，70個(gè)獨(dú)立基因，長(zhǎng)度255bp～3110bp。通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索對(duì)得到的EST進(jìn)行功能注釋?zhuān)Y(jié)果表明：此次共發(fā)現(xiàn)功能已知基因45個(gè)代表86條EST，功能未定的假想蛋白質(zhì)5個(gè)代表13條EST，相似性較低的未鑒定基因8個(gè)代表10

5、條EST，無(wú)顯著相似性的基因12個(gè)代表17條EST。同源性最大的蛋白質(zhì)主要來(lái)源于豆科、擬南芥、水稻等植物中與植物體內(nèi)代謝過(guò)程和抗性相關(guān)的酶和蛋白質(zhì)。對(duì)37個(gè)功能明確的Unigene進(jìn)行Clustal多序列比較分析，親緣樹(shù)分類(lèi)結(jié)果與功能注釋結(jié)果基本一致，基因功能解析在基因結(jié)構(gòu)分類(lèi)上有所體現(xiàn)。通過(guò)查詢(xún)得到與類(lèi)黃酮、糖類(lèi)、氨基酸等多種有效成分相關(guān)的代謝途徑，為進(jìn)一步甘草功能基因的研究奠定了良好的理論基礎(chǔ)。 (4)分析了甘草的全長(zhǎng)基因特

6、征對(duì)得到的EST進(jìn)行聚類(lèi)和電子拼接，得到了3條全長(zhǎng)基因，分別為與木質(zhì)素合成關(guān)系密切的肉桂醇脫氫酶基因、與糖代謝關(guān)系密切的ATP-檸檬酸裂解酶基因和與季節(jié)相關(guān)的植物冬眠聯(lián)合蛋白基因，并對(duì)基因的編碼區(qū)域、啟動(dòng)子和酶切位點(diǎn)進(jìn)行了分析。 (5)注冊(cè)了58條EST和10條全長(zhǎng)或部分基因序列在GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中注冊(cè)了58條EST序列和10條基因序列，其中3條基因?yàn)楦什莸娜L(zhǎng)基因，GeneBank Accession分別為ES34682

7、4～ES346881、 EF571294～EF571303。 (6)初步探討了所獲得基因的功能通過(guò)對(duì)注釋得到甘草基因功能的分析，對(duì)甘草基因的功能進(jìn)行了推測(cè)。結(jié)果表明此次獲得的甘草基因功能多表現(xiàn)在與甘草生理特征或成分積累和合成相關(guān)的各種代謝酶以及抗逆性等方面。 本論文的特色和創(chuàng)新之處如下： (1)對(duì)于甘草的基因研究，國(guó)內(nèi)起步較晚，光果甘草和歐甘草報(bào)道較多，而烏拉爾甘草相對(duì)較少，對(duì)于烏拉爾甘草的cDNA文庫(kù)的構(gòu)建和E

8、ST分析并未見(jiàn)報(bào)道。本文建立了適用于甘草地上和地下部分的RNA提取方法，構(gòu)建了烏拉爾甘草根部組織的cDNA文庫(kù)，同時(shí)為富含多糖的植物組織的cDNA文庫(kù)的構(gòu)建提供了可借鑒的依據(jù)。 (2)應(yīng)用隨機(jī)測(cè)序技術(shù)對(duì)藥用植物cDNA文庫(kù)進(jìn)行分析已有不少報(bào)道，但是對(duì)于甘草的EST分析并未見(jiàn)報(bào)道。本文通過(guò)對(duì)烏拉爾甘草根部組織cDNA文庫(kù)的篩選，獲得了大量的功能注釋信息，并在GeneBank中注冊(cè)了10條全長(zhǎng)或部分基因序列，58條高質(zhì)量的EST序列