小麥品質(zhì)相關(guān)γ類醇溶蛋白基因TaWG04的克隆與表達(dá)分析.pdf

1、普通小麥及其近緣屬物種中均含有豐富的醇溶蛋白，這些麥醇溶蛋白基因與小麥品質(zhì)性狀顯著相關(guān)，克隆醇溶蛋白基因并對(duì)其進(jìn)行表達(dá)與功能分析，是研究醇溶蛋白分析結(jié)構(gòu)及其與品質(zhì)關(guān)系的有效途徑。本文以優(yōu)質(zhì)強(qiáng)筋小麥鄭麥366與典型弱筋小麥鄭麥004為實(shí)驗(yàn)材料，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析結(jié)合Real-time PCR技術(shù)篩選差異表達(dá)基因，分離克隆出一個(gè)胚乳特異性表達(dá)的對(duì)小麥品質(zhì)起負(fù)效應(yīng)的γ-醇溶蛋白多基因 TaWG04，并分析了該基因的表達(dá)調(diào)控模式。
　

2、　主要結(jié)果如下：
　　（1）通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，篩選到10個(gè)在弱筋小麥鄭麥004中強(qiáng)表達(dá)的醇溶蛋白基因。Real-time PCR進(jìn)一步驗(yàn)證，獲得7個(gè)醇溶蛋白基因在弱筋小麥鄭麥004中強(qiáng)表達(dá)，其中TaWG04和TaWG05編碼γ-醇溶蛋白基因在強(qiáng)筋品種鄭麥366中表達(dá)量最低。
　?。?）通過(guò)cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)克隆TaWG04基因全長(zhǎng)，得到1144bp的片段，其中包含有5’端序列101bp，3’端序列68bp，和一個(gè)97

3、5bp的完整開(kāi)放讀碼框（A6），編碼324個(gè)氨基酸，其中包含有21個(gè)氨基酸數(shù)目的信號(hào)肽序列。
　?。?）通過(guò)生物信息學(xué)尋找TaWG04基因的同源序列，根據(jù)同源序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)3對(duì)引物，進(jìn)行克隆測(cè)序，共獲得33條基因序列，推導(dǎo)氨基酸序列結(jié)構(gòu)特征并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)F25基因提前終止，推測(cè)為假基因，其余序列中均含有8個(gè)半胱氨酸殘基，具有典型的γ-醇溶蛋白結(jié)構(gòu)特征。
　?。?）通過(guò)Real-time PCR分析TaWG04基

4、因在種子發(fā)育不同階段（授粉后7天、14天、21天、28天與35天）與不同部位（露白48h、幼苗7天、根、莖、葉、雄蕊、雌蕊、胚與胚乳）的時(shí)空表達(dá)特征，結(jié)果表明該基因只在胚乳中表達(dá)，并可以在授粉14天時(shí)檢測(cè)到表達(dá)量，隨后逐步增強(qiáng)，28天時(shí)達(dá)到最大量，隨后表達(dá)量減少。
　　（5）選擇典型強(qiáng)筋類品種師欒02-1、西農(nóng)979、新麥26、鄭麥366、鄭麥9023以及非強(qiáng)筋類品種矮抗58、焦麥266、豫麥13、鄂麥352、鄭麥004、周麥13

5、品種進(jìn)行Real-time PCR分析，發(fā)現(xiàn)TaWG04基因在強(qiáng)筋品種中表達(dá)普遍受到抑制，表明TaWG04可能負(fù)調(diào)控小麥的強(qiáng)筋品質(zhì)。
　?。?）根據(jù)A6設(shè)計(jì)不擴(kuò)增信號(hào)肽的表達(dá)引物，回收目的片段與pET32a載體分別用BamH I和HindШ進(jìn)行雙酶切，連接轉(zhuǎn)化到受體菌E.coli Rosetta(DE3)中，成功地構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-32a-γ-A6，測(cè)序驗(yàn)證后進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)與親和層析純化，最

6、終獲得目的蛋白濃度為4mg/ml并且確定蛋白位于包涵體中。
　　（7）制備多克隆抗體與Western Blotting檢測(cè)，最終獲得抗體的濃度為1.33mg/ml，能特異性的識(shí)別重組蛋白，大小在55kd左右，與抗原蛋白表達(dá)情況基本相符，具有良好的免疫原性。
　?。?）選擇強(qiáng)筋類小麥品種鄭麥366，西農(nóng)979，陜優(yōu)225與弱筋類小麥品種周8425B，周麥9號(hào)，矮抗58，周麥16，周麥13等進(jìn)行Western Blotting分