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文檔簡介
1、目的:
類風濕性關節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是以慢性多關節(jié)滑膜炎,骨及軟骨破壞為主要特征的全身性自身免疫性疾病。在我國是一種常見病、多發(fā)病。雖然目前其確切的發(fā)病機制尚不明確,但一般認為,自身反應性T細胞在局部的形成是該病重要的起動因素之一。近幾年來的研究發(fā)現(xiàn)新的輔助性T細胞新亞群,主要有調節(jié)性T細胞和Th17細胞,在包括RA在內的多種自身免疫性疾病的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。本研究目的:建立調
2、節(jié)性T細胞和Th17細胞的流式細胞術檢測方法,探明RA時這兩種新亞群在外周血中的分布特征;然后進一步分析導致該免疫狀態(tài)的分子機制,明確Notch信號分子在RA外周血T細胞中的表達特性;最后再證實Notch信號可能通過參與輔助性T細胞的功能性分化介導關節(jié)炎的發(fā)生。通過本研究可望進一步明確RA的發(fā)病機制并為發(fā)展基于干預Notch信號的免疫治療提供理論依據(jù)。
方法:
1、建立流式細胞術細胞內染色技術檢測調節(jié)性T細胞
3、和Th17細胞的方法。外周血單個核細胞表面分子標記后,再經固定/透膜處理進行細胞內染色,采用流式細胞術檢測T細胞內FoxP3或IL-17。同時分析不同刺激劑對Th17細胞檢測結果的影響。
2、選取活動期及穩(wěn)定期RA患者,采用流式細胞術細胞內染色技術檢測外周血中調節(jié)性T細胞和Th17細胞百分比。并應用定量PCR的方法,分別檢測這兩種細胞特異的轉錄因子FoxP3與RORγt的mRNA表達水平。并與正常人結果進行比較。
4、 3、RA患者同時檢測調節(jié)性T細胞和Th17細胞百分比,計算Th17/Treg比值。同時采用流式芯片技術檢測血清中11種細胞因子,觀察外周血中細胞因子微環(huán)境特征,并分析與Th17/Treg比值的相關性。
4、采用流式細胞術檢測RA外周血T細胞Notch受體分子的表達。應用免疫磁珠分離純化外周血T細胞,通過定量PCR的方法檢測Notch受體及靶基因的mRNA表達水平。應用Western Blot檢測T細胞內Notch胞內
5、段(Notchintra-cellular domain,NICD)核移位。
5、采用Ⅱ型膠原加弗氏完全佐劑免疫DBA/1J小鼠,取脾臟單個核細胞體外培養(yǎng),同時加入Ⅱ型膠原,從而建立膠原特異的體外增殖系統(tǒng)。采用多種方法包括:Notch信號非特異的阻斷劑DAPT、Notch受體的單克隆抗體、Notch配體的融體蛋白來干預膠原特異的體外增殖反應,觀察對T細胞增殖及Th1和Th17極化的影響。
結果:
6、 1、FoxP3分子主要表達于CD4+T細胞,尤其是高表達CD25的CD4+T細胞,達97%左右。同時中等程度表達CD25的細胞中也含有少量FoxP3陽性細胞。T細胞活化后,表達FoxP3的CD4+CD25+T細胞比例顯著增高,流式細胞術檢測結果與定量PCR結果一致。
2、RA患者CD4和CD25雙陽性細胞所占比例與對照組沒有明顯差異,而活動期患者外周血CD4+CD25high和CD4+CD25+FoxP3+細胞明顯低于穩(wěn)
7、定期和對照組(p<0.05)?;顒悠赗A患者外周血CD3+CD8-IL-17+細胞(Th17細胞)明顯多于穩(wěn)定期,二者均多于正常對照組(P<0.05)。RA患者外周血Th1細胞呈現(xiàn)與Th17細胞類似的分布特點。
3、穩(wěn)定期組Th17/Treg比值(0.29±0.13)明顯高于健康對照組(0.11±0.4)?;顒悠诮MTh17/Treg比值增加更為明顯,達1.31±0.5。穩(wěn)定期患者血清中Th1和Th17相關細胞因子明顯增多,
8、如IL-12,IFN-γ,IL-2,IL-6,IL-1β和TNF-α(P<0.05)。但穩(wěn)定期組此類因子水平又低于活動期組(P<0.05)。與對照組相比,血清IL-4,IL-5,IL-10水平在穩(wěn)定期組及活動期組均明顯升高,但兩疾病組間沒有明顯差異(P>0.05)。三組間血清IL-8,TNF-β水平未見明顯差異(P>0.05)。Th17/Treg比值與血清IFN-γ(r=0.650,P<0.05),IL-6(r=0.813,P<0.01
9、),IL-1β(r=0.713,P<0.01),和TNF-α(r=0.6263,P<0.05)均呈顯著正相關。
4、與正常人相比,RA患者T細胞Notch2、Notch3及Notch4表達量增加(P<0.01),其中Notch3主要表達于活化的T細胞,而Notch1水平在二者間未見明顯差異。全細胞NICD水平在RA活動期、穩(wěn)定期及對照間無明顯差異,但活動期組細胞核中的NICD水平明顯高于后兩者,即出現(xiàn)明顯NICD核移位
10、r> 5、膠原特異性體外增殖體系中分泌Th1細胞和Th17細胞百分比明顯增加(P<0.05)。刺激前后調節(jié)性T(CD4+CD25+FoxP3+)百分比未見明顯變化(P>0.05)。膠原再次刺激可誘導CD4+T細胞Hes1 mRNA表達水平增加。Notch3受體分子mRNA水平也明顯增加,但其它三種受種分子未見明顯變化。DAPT和Notch3的單克隆抗體均能抑制膠原特異性T細胞增殖及向Th1和Th17方向分化。Delta-like1
11、融合蛋白促進膠原特異性T細胞向Th1和Th17方向分化,未影響到調節(jié)性T細胞的百分比。
結論:
1、類風濕性關節(jié)炎患者外周血存在Treg/Th17失衡,調節(jié)性T細胞(Treg)百分比下降,而Th17細胞比例明顯增加,呈現(xiàn)向Th17細胞優(yōu)勢極化的格局。
2、流式細胞術細胞內染色技術可在單細胞水平檢測調節(jié)性T細胞和Th17細胞,轉錄因子FoxP3可作為調節(jié)性T細胞的檢測標志物。
3、類
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