類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎Treg-Th17免疫平衡分析及Notch信號的調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是以慢性多關(guān)節(jié)滑膜炎，骨及軟骨破壞為主要特征的全身性自身免疫性疾病。在我國是一種常見病、多發(fā)病。雖然目前其確切的發(fā)病機(jī)制尚不明確，但一般認(rèn)為，自身反應(yīng)性T細(xì)胞在局部的形成是該病重要的起動因素之一。近幾年來的研究發(fā)現(xiàn)新的輔助性T細(xì)胞新亞群，主要有調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和Th17細(xì)胞，在包括RA在內(nèi)的多種自身免疫性疾病的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。本研究目的：建立調(diào)

2、節(jié)性T細(xì)胞和Th17細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)檢測方法，探明RA時這兩種新亞群在外周血中的分布特征；然后進(jìn)一步分析導(dǎo)致該免疫狀態(tài)的分子機(jī)制，明確Notch信號分子在RA外周血T細(xì)胞中的表達(dá)特性；最后再證實Notch信號可能通過參與輔助性T細(xì)胞的功能性分化介導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。通過本研究可望進(jìn)一步明確RA的發(fā)病機(jī)制并為發(fā)展基于干預(yù)Notch信號的免疫治療提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1、建立流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞內(nèi)染色技術(shù)檢測調(diào)節(jié)性T細(xì)胞

3、和Th17細(xì)胞的方法。外周血單個核細(xì)胞表面分子標(biāo)記后，再經(jīng)固定/透膜處理進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測T細(xì)胞內(nèi)FoxP3或IL-17。同時分析不同刺激劑對Th17細(xì)胞檢測結(jié)果的影響。
　　 2、選取活動期及穩(wěn)定期RA患者，采用流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞內(nèi)染色技術(shù)檢測外周血中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和Th17細(xì)胞百分比。并應(yīng)用定量PCR的方法，分別檢測這兩種細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄因子FoxP3與RORγt的mRNA表達(dá)水平。并與正常人結(jié)果進(jìn)行比較。
　

4、　 3、RA患者同時檢測調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和Th17細(xì)胞百分比，計算Th17/Treg比值。同時采用流式芯片技術(shù)檢測血清中11種細(xì)胞因子，觀察外周血中細(xì)胞因子微環(huán)境特征，并分析與Th17/Treg比值的相關(guān)性。
　　 4、采用流式細(xì)胞術(shù)檢測RA外周血T細(xì)胞Notch受體分子的表達(dá)。應(yīng)用免疫磁珠分離純化外周血T細(xì)胞，通過定量PCR的方法檢測Notch受體及靶基因的mRNA表達(dá)水平。應(yīng)用Western Blot檢測T細(xì)胞內(nèi)Notch胞內(nèi)

5、段(Notchintra-cellular domain，NICD)核移位。
　　 5、采用Ⅱ型膠原加弗氏完全佐劑免疫DBA/1J小鼠，取脾臟單個核細(xì)胞體外培養(yǎng)，同時加入Ⅱ型膠原，從而建立膠原特異的體外增殖系統(tǒng)。采用多種方法包括：Notch信號非特異的阻斷劑DAPT、Notch受體的單克隆抗體、Notch配體的融體蛋白來干預(yù)膠原特異的體外增殖反應(yīng)，觀察對T細(xì)胞增殖及Th1和Th17極化的影響。
　　 結(jié)果：
　　

6、 1、FoxP3分子主要表達(dá)于CD4+T細(xì)胞，尤其是高表達(dá)CD25的CD4+T細(xì)胞，達(dá)97％左右。同時中等程度表達(dá)CD25的細(xì)胞中也含有少量FoxP3陽性細(xì)胞。T細(xì)胞活化后，表達(dá)FoxP3的CD4+CD25+T細(xì)胞比例顯著增高，流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果與定量PCR結(jié)果一致。
　　 2、RA患者CD4和CD25雙陽性細(xì)胞所占比例與對照組沒有明顯差異，而活動期患者外周血CD4+CD25high和CD4+CD25+FoxP3+細(xì)胞明顯低于穩(wěn)

7、定期和對照組(p<0.05)?；顒悠赗A患者外周血CD3+CD8-IL-17+細(xì)胞(Th17細(xì)胞)明顯多于穩(wěn)定期，二者均多于正常對照組(P<0.05)。RA患者外周血Th1細(xì)胞呈現(xiàn)與Th17細(xì)胞類似的分布特點。
　　 3、穩(wěn)定期組Th17/Treg比值(0.29±0.13)明顯高于健康對照組(0.11±0.4)?；顒悠诮MTh17/Treg比值增加更為明顯，達(dá)1.31±0.5。穩(wěn)定期患者血清中Th1和Th17相關(guān)細(xì)胞因子明顯增多，

8、如IL-12，IFN-γ，IL-2，IL-6，IL-1β和TNF-α(P<0.05)。但穩(wěn)定期組此類因子水平又低于活動期組(P<0.05)。與對照組相比，血清IL-4，IL-5，IL-10水平在穩(wěn)定期組及活動期組均明顯升高，但兩疾病組間沒有明顯差異(P>0.05)。三組間血清IL-8，TNF-β水平未見明顯差異(P>0.05)。Th17/Treg比值與血清IFN-γ(r=0.650，P<0.05)，IL-6(r=0.813，P<0.01

9、)，IL-1β(r=0.713，P<0.01)，和TNF-α(r=0.6263，P<0.05)均呈顯著正相關(guān)。
　　 4、與正常人相比，RA患者T細(xì)胞Notch2、Notch3及Notch4表達(dá)量增加(P<0.01)，其中Notch3主要表達(dá)于活化的T細(xì)胞，而Notch1水平在二者間未見明顯差異。全細(xì)胞NICD水平在RA活動期、穩(wěn)定期及對照間無明顯差異，但活動期組細(xì)胞核中的NICD水平明顯高于后兩者，即出現(xiàn)明顯NICD核移位

10、r>　　 5、膠原特異性體外增殖體系中分泌Th1細(xì)胞和Th17細(xì)胞百分比明顯增加(P<0.05)。刺激前后調(diào)節(jié)性T(CD4+CD25+FoxP3+)百分比未見明顯變化(P>0.05)。膠原再次刺激可誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞Hes1 mRNA表達(dá)水平增加。Notch3受體分子mRNA水平也明顯增加，但其它三種受種分子未見明顯變化。DAPT和Notch3的單克隆抗體均能抑制膠原特異性T細(xì)胞增殖及向Th1和Th17方向分化。Delta-like1

11、融合蛋白促進(jìn)膠原特異性T細(xì)胞向Th1和Th17方向分化，未影響到調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的百分比。
　　 結(jié)論：
　　 1、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血存在Treg/Th17失衡，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)百分比下降，而Th17細(xì)胞比例明顯增加，呈現(xiàn)向Th17細(xì)胞優(yōu)勢極化的格局。
　　 2、流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞內(nèi)染色技術(shù)可在單細(xì)胞水平檢測調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和Th17細(xì)胞，轉(zhuǎn)錄因子FoxP3可作為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的檢測標(biāo)志物。
　　 3、類