丁醇發(fā)酵菌種的篩選及鑒定.pdf

1、目的： 以丁醇產(chǎn)生菌的生理特性與代謝特點(diǎn)，建立高效快速的篩選方法，從土壤及植物器官中篩選具有較高丁醇生產(chǎn)能力的丁醇發(fā)酵細(xì)菌。對(duì)篩選到的菌株進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)與16S rDNA鑒定，初步鑒定確定其分類地位；考察該篩選菌的發(fā)酵特性，對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以進(jìn)一步提高丁醇產(chǎn)量。
　　 方法：
　　 已知丙酮丁醇發(fā)酵細(xì)菌都是能產(chǎn)生耐高溫芽孢的厭氧菌，通過(guò)熱處理方法殺死細(xì)菌細(xì)胞以富集芽孢，厭氧環(huán)境培養(yǎng)來(lái)淘汰好氧菌，涂布平板培養(yǎng)挑取單

2、菌落分離純化。對(duì)得到的單菌株進(jìn)行發(fā)酵，通過(guò)丙酮定性試驗(yàn)檢測(cè)發(fā)酵液中丙酮含量，淘汰雜菌與溶劑產(chǎn)生能力弱的細(xì)菌。根據(jù)丁醇發(fā)酵過(guò)程中前期產(chǎn)酸，后期將酸還原成丙酮、丁醇的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了溴甲酚綠平板鑒別產(chǎn)酸能力，美藍(lán)褪色判斷還原能力的方法來(lái)篩選同時(shí)具有較強(qiáng)產(chǎn)酸能力和還原能力的細(xì)菌。最后對(duì)篩選到的少量菌株進(jìn)行發(fā)酵，通過(guò)氣相色譜定量檢測(cè)發(fā)酵液中的丁醇含量，得到最優(yōu)菌株sat3，對(duì)該菌株進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)和16S rDNA的27f—1492r區(qū)段序列測(cè)序，

3、將得到的序列在GeneBank的Blast中進(jìn)行相似比對(duì)，下載相似最高的8個(gè)序列，通過(guò)MEGA4.1軟件構(gòu)件系統(tǒng)發(fā)育樹，初步確定其分類地位，并優(yōu)化其發(fā)酵條件。
　　 結(jié)果：
　　 1、通過(guò)采集土樣和馬鈴薯塊莖，進(jìn)行了丁醇生產(chǎn)菌的篩選。經(jīng)過(guò)熱處理富集、丙酮定性檢測(cè)、溴甲酚綠平板鑒別產(chǎn)酸能力和美藍(lán)褪色還原判斷還原能力，最后篩選到了3株菌株，再經(jīng)過(guò)發(fā)酵檢測(cè)產(chǎn)物含量，得到菌株sat3，其丁醇產(chǎn)量為8.32g/L。
　　

4、2、對(duì)菌株sat3菌株進(jìn)行了形態(tài)觀察、染色反應(yīng)和生理生化檢測(cè)，初步確定其為梭菌屬，再通過(guò)擴(kuò)增16S rDNA片段，比較相似性和同源性，結(jié)果證實(shí)了菌株sat3屬于梭狀芽孢桿菌屬。
　　 3、對(duì)sat3菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，在初始pH為5.5，玉米培養(yǎng)基濃度為7%，發(fā)酵溫度37℃時(shí)，丁醇產(chǎn)量較佳，可達(dá)9.10g/L。
　　 結(jié)論：
　　 1、利用熱處理法能有效富集丙酮丁醇菌產(chǎn)生的耐熱芽孢，淘汰不能產(chǎn)生芽孢的雜菌，