山羊Agouti基因5’UTR變異及ASIP蛋白表達(dá)定位研究.pdf

1、山羊皮膚組織中Agouti基因非翻譯區(qū)的變異可能與該基因的表達(dá)存在某種特定關(guān)系,進而影響被毛顏色的變化;同時,啟動子區(qū)變異對啟動子活性的影響可能直接對基因表達(dá)產(chǎn)生影響,而Agouti基因在皮膚組織表達(dá)部位的不同可能會引起黑色素分布的不同,進而引起被毛顏色的表型變異,因此這些關(guān)鍵科學(xué)問題的研究是解決山羊被毛顏色分子遺傳機制的重要途徑。
　　 根據(jù)本試驗室前期所測山羊Agouti基因部分序列(EF587236.2)和GenBank上

2、已發(fā)表的綿羊Agouti基因序列(EU185099)進行引物設(shè)計,選擇濟寧青山羊(JNG)、遼寧絨山羊(LN)、雷州黑山羊(LZ)各30只,南疆黃羊快長系(NJF)32只,染色體步移方法擴增山羊Agouti基因5’UTR區(qū),總擴增片段長度為7357bp,已提交到GenBank,序列號為JN651404。利用DNAMAN軟件將JN651404與EF587236.2進行拼接,拼接序列長度為12847bp。再利用Spidey軟件和綿羊mRNA

3、(NM001134303.1)對所獲得的12847bp進行外顯子、內(nèi)含子預(yù)測,確定了JN651404包括90bp的外顯子1和7267bp的5’UTR,并確定了山羊Agouti基因翻譯起始位點A位點為7679位點。在此基礎(chǔ)上,利用NeuralNetworkPromoterPrediction啟動子在線分析軟件和TFSEARCH軟件預(yù)測出山羊Agouti基因的一個候選啟動子區(qū)-6450-7100bp。
　　 對啟動子區(qū)進行群體測序分

4、析后得到三個突變位點,根據(jù)拼接結(jié)果命名這些突變位點,分別為g.C6474T,g.C6579T和g.T6703A。經(jīng)群體遺傳學(xué)分析后得出g.C6474T位點的CC基因型,g.C6579T位點的CC基因型以及g.T6703A位點的TT基因型與山羊黑色表型相關(guān)。三個突變位點之間存在連鎖不平衡關(guān)系,且CCT單倍型為JNG,LZ,LN和NJF四個山羊品種的最原始單倍型,此單倍型也與山羊黑色被毛表型有關(guān)。
　　 選用2只白色太行山羊,1只黑

5、色太行山羊腹部皮膚組織,通過RACE試驗對山羊mRNA進行測序研究,得到了一88bp長度的片段,由于在進行BLAST時此片段并不位于綿羊、豬等的5’UTR區(qū),加上Agouti基因的外顯子1在不同生物中存在很多剪接體類型,也沒有前人對山羊的5’UTR區(qū)進行過研究,所以不能斷定此片段是否就是山羊Agouti基因5’UTR的一部分
　　 分別選用5只白色,5只黑色和5只棕色太行山羊腹部皮膚組織,進行山羊群體Agouti基因mRNA轉(zhuǎn)錄

6、定量研究,結(jié)果表明Agouti基因mRNA在不同皮毛顏色山羊皮膚組織中轉(zhuǎn)錄量為:白色(0.8131±0.0577)＞棕色(0.5571±0.0736)＞黑色(0.3991±0.0289)。而在Agouti基因表達(dá)蛋白ASIP的定位研究(分別選用了3只白色,黑色,棕色太行山羊)中發(fā)現(xiàn):在白色、黑色和棕色山羊皮膚組織的表皮、真皮中ASIP均沒有表達(dá);在黑色與棕色山羊皮膚組織毛囊外根鞘有大量表達(dá),但在白色山羊皮膚組織毛囊組織中沒有發(fā)現(xiàn)ASIP