阿米洛利降低蛋白尿的實驗研究.pdf

1、背景：蛋白尿是腎臟疾病主要的臨床表現(xiàn)之一,也是腎臟病持續(xù)性進展的重要因素。一系列大型臨床研究均證實:蛋白尿的多寡以及持續(xù)時間均直接關(guān)系腎臟疾病的預后。足細胞作為腎小球固有細胞之一,附著于腎小球基底膜(glomerularbasement membrane,GBM)的外側(cè),與腎小球基底膜以及毛細血管內(nèi)皮細胞構(gòu)成腎小球的濾過屏障。作為腎小球血液濾過的最后屏障,足細胞(podocyte)的改變幾乎參與了所有的蛋白尿相關(guān)性腎病的發(fā)生,并在蛋白尿

2、相關(guān)性腎臟疾病發(fā)展進程中起著關(guān)鍵作用。足細胞已經(jīng)成為針對蛋白尿研究的關(guān)鍵細胞,闡明足細胞損傷的分子機制具有重要意義。
　　 目前對足細胞分子結(jié)構(gòu)的研究主要集中在①裂孔隔膜復合體(SDs)區(qū),包括:nephrin、podocin、ZO-1,CD2AP,P-cadherin,FAT等；②頂端膜蛋白區(qū):Podocalyxin、GLEPP-1；③基底膜相接觸的基底蛋白區(qū):α3β1整合素、Dystroglycan(DG)；④足細胞骨架蛋白

3、:synaptopodin、α-actinin-4、F-actin等。然而遺憾的是,盡管通過一些單基因或遺傳性腎病綜合征的研究,對足細胞結(jié)構(gòu)的認識有了很大進展,但對足細胞損傷機制的認識仍未取得重大進展。目前,臨床上蛋白尿的治療缺乏直接針對靶細胞-足細胞損傷分子機制的治療。
　　 最新研究(Nat Med,2008)發(fā)現(xiàn):在人類腎小球疾病、PAN腎病動物模型以及LPS誘導的蛋白尿動物/細胞模型中,尿激酶受體(urokinase r

4、eceptor,uPAR)表達增加可導致足細胞活動增強并導致蛋白尿的產(chǎn)生。uPAR一種糖基化磷脂酰肌醇(GPI)錨定蛋白,能與一些跨膜蛋白如整合素、小窩蛋白等結(jié)合形成信號復合體,在炎癥、腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移起著重要作用。研究進一步發(fā)現(xiàn):基因敲除uPAR(plaur-/-)小鼠同時予LPS處理,明顯減少蛋白尿發(fā)生；轉(zhuǎn)入表達的uPAR(plaur cDNA)并予LPS處理,可以讓已經(jīng)敲除uPAR基因的小鼠(plaur-/-)重新出現(xiàn)蛋白尿；這一發(fā)

5、現(xiàn)證明:uPAR的表達增加,可以導致蛋白尿的發(fā)生。由此可見:足細胞上uPAR是蛋白尿發(fā)生機制中有著其獨特作用。
　　 阿米洛利(amiloride)是一種Na通道阻滯劑,已作為利尿藥在臨床上使用。有研究提示:在克隆的腫瘤細胞株,amiloride可以從mRNA及蛋白兩個水平,抑制其uPAR的表達,從而降低細胞的活動力。那么,在足細胞上,amiloride是否能抑制uPAR的表達,降低足細胞的活動力呢?由此,本研究提出這樣的假設,

6、在損傷足細胞及蛋白尿動物模型上,amiloride能通過抑制uPAR的表達,同時降低足細胞活動力,穩(wěn)定足細胞,以期達到降蛋白尿的作用。為了驗證上述假說本研究通過建立脂多糖誘導小鼠短暫蛋白尿模型和經(jīng)典的5/6腎切除大鼠模型蛋白尿模型以及體外脂多糖誘導足細胞損傷模型,分別從體內(nèi)及體外實驗,RNA及蛋白質(zhì)兩個水平觀察阿米洛利對uPAR表達的影響,初步探討阿米洛利的降蛋白尿的作用機制,擬為未來在針對足細胞靶細胞水平上治療蛋白尿提供一種新的治療藥

7、物。
　　 方法：
　　 一、建立脂多糖誘導小鼠短暫蛋白尿模型和經(jīng)典的5/6腎切除大鼠模型蛋白尿模型,觀察阿米洛利對蛋白尿的影響
　　 (一)脂多糖誘導小鼠短暫蛋白尿模型制作:18只C57BL/6雄性小鼠隨機分為正常對照組(Con)、LPS處理組(LPS)、LPS與amiloride共同處理組(LPS+amiloride),每組6只。LPS組及LPS+amiloride組腹腔注射LPS200ug,Con組給予等量

8、生理鹽水腹腔注射,LPS+amiloride組提前二天給予amiloride10mg·kg-1·d-1灌胃,Con組及LPS組每天給予等量生理鹽水灌胃。
　　 (二)5/6腎切除大鼠模型的制作:43只SD雄性大鼠隨機分為假手術(shù)對照組(Sham)14只、5/6腎切除組(NTX)14只、5/6腎切除+amiloride干預組(NTX+amiloride)15只。NTX+amiloride組行5/6腎切除手術(shù),一周后每日給予amilo

9、ride3mg·kg-1灌胃,NTX組行5/6腎切除手術(shù),一周后每日給予等量生理鹽水灌胃,Sham組行假手術(shù),一周后每日給予等量生理鹽水灌胃。
　　 (三)時間點設置及24小時尿蛋白檢測:脂多糖誘導小鼠蛋白尿模型于第3天留取24h尿液檢測蛋白濃度后處死并留取腎組織,5/6腎切除大鼠模型分別于2周、4周、8周、12周留取24小時尿液檢測尿蛋白量后處死并取腎組織。
　　 二、觀察阿米洛利對足細胞活動力的影響
　　 (

10、一)足細胞培養(yǎng):條件永生性小鼠足細胞由Baylor醫(yī)學院Danesh教授惠贈。首先在5％CO2,33℃培養(yǎng)箱環(huán)境,用含20—100U·mL-1IFN-γ的RPMI1640和10％FBS放入Ⅰ型膠原包被的培養(yǎng)瓶中共孵育,使其獲得增殖能力。然后轉(zhuǎn)入5％CO2,37℃培養(yǎng)箱,用不含IFN-γ的DMEM加10％FBS共孵育,經(jīng)10-14天的培養(yǎng)誘導,足細胞進入分化階段并最終分化成熟。
　　 (二)足細胞鑒定及形態(tài)學觀察:分別對33℃含I

11、FN-γ培養(yǎng)及37℃不含IFN—γ培養(yǎng)10-14天分化成熟后的足細胞在相差顯微鏡下直接拍片,觀察其形態(tài)學差異；免疫熒光采用表達足細胞骨架蛋白synaptopodin的細胞為分化成熟的足細胞,未分化的足細胞不表達synaptopodin蛋白。
　　 (三)按以下分組干預處理足細胞:
　　 1)正常對照組(Con):不加任何干預因素分化成熟的足細胞；
　　 2)LPS組(LPS):50·mg·L-1脂多糖與成熟足細胞

12、共同孵育24h；
　　 3)LPS與amiloride共同干預組(LPS+amiloride):用50·mg·L-1脂多糖分別與50·mg·L-1阿米洛利共同干預24h；
　　 (四)轉(zhuǎn)板遷移測定法(Transwell migration assay):使用龍膽紫染色后,在倒置顯微鏡下攝片,觀察Con組、LPS處理組及LPS與amiloride共同干預組足細胞遷移的變化。
　　 (五)刮除法(Wound heal

13、ing assay):在Ⅰ型膠原包被的六孔板爬片上培養(yǎng)細胞后,刮除細胞后給予不同的處理,24小時后觀察Con組、LPS處理組及LPS與amiloride共同干預組足細胞損傷修復的變化情況。
　　 三、阿米洛利對足細胞uPAR表達的影響
　　 (一)脂多糖誘導小鼠短暫蛋白尿模型和經(jīng)典的5/6腎切除大鼠模型蛋白尿模型,觀察阿米洛利對uPAR表達的影響
　　 1)行兩種動物模型中腎組織冰凍切片,并免疫熒光激光共聚焦觀察

14、synaptopodin、uPAR表達。
　　 2)提取兩種動物模型中腎臟組織mRNA,real-time PCR檢測各組plaurmRNA表達。
　　 (二)體外實驗觀察觀察阿米洛利對uPAR表達的影響
　　 1)觀察阿米洛利對足細胞uPAR mRNA(plaur mRNA)表達影響:將上述各實驗分組提取細胞RNA后,并用real-time PCR檢測各組plaur mRNA表達。
　　 2)觀察阿米洛

15、利對足細胞uPAR蛋白表達影響
　　 ①通過流式細胞術(shù)檢測上述實驗分組uPAR蛋白的表達；
　　 ②運用免疫熒光檢測Con組、LPS組、LPS與amiloride共同干預組uPAR蛋白表達；
　　 四、統(tǒng)計學處理計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差((X)±S)表示,應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析,結(jié)果用單因素方差分析(One-way ANOVA)方法,方差齊性用LSD法進行組間多重比較,方差不齊用Dunnet

16、t's T3法進行組間多重比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果：
　　 一、阿米洛利可以降低脂多糖誘導小鼠短暫蛋白尿模型和5/6腎切除大鼠蛋白尿模型中的蛋白尿
　　 (一)脂多糖誘導小鼠短暫蛋白尿模型中各組蛋白尿的變化:
　　 與Con組相比較,LPS組24小時蛋白尿明顯升高[(4.12±1.06)mg vs(1.35±0.68)mg；p=0.000],有統(tǒng)計學意義；而與LPS組相比較,LP

17、S+amiloride組尿蛋白明顯降低[(4.12±1.06)mg vs(1.99±0.96)mg；p=0.001],有統(tǒng)計學意義；LPS+amiloride組24蛋白尿與Con組相比無統(tǒng)計學意義(p=0.244)。
　　 (二)SD大鼠5/6腎切除模型各組尿蛋白變化:
　　 第2周時,與假手術(shù)對照組(Sham)相比較,5/6腎切除組(NTX)24小時尿蛋白明顯升高[(47.50±28.05)mg vs(14.28±3.

18、8)mg,P=0.023],有統(tǒng)計學意義；與NTX組相比,5/6腎切除并用amiloride干預組(NTX+amiloride)24小時尿蛋白無統(tǒng)計學意義[(51.56±21.03)mg vs(47.50±28.05)mg,P=0.748]。第4周時,與Sham組及NTX+amiloride組相比較,NTX組24小時尿蛋白無明顯升高[(50.09±22.34)mg vs(21.77±5.29)mg,P=0.112；(50.09±22.3

19、4)mg vs(33.52±10.11)mg,P=0.411],無統(tǒng)計學意義。第8周時,與NTX組[(162.39±27.62)mg]相比,NTX+amiloride組[(109.22±31.26)mg]、sham組[(19.38±8.26)mg]24小時尿蛋白增加量均明顯較低,有統(tǒng)計學意義[P值分別為0.004,0.000]。第12周時,與NTX組[(188.31±29.82)mg]相比,NTX+amiloride組[(121.37±

20、31.14)mg]、sham組[(21.32±8.59)mg]24小時尿蛋白增加量均進一步減少,具有統(tǒng)計學意義[P值分別為0.001,0.000]。
　　 二、足細胞形態(tài)學觀察及鑒定結(jié)果足細胞在33℃含IFN-γ培養(yǎng)基下培養(yǎng),呈鵝卵石樣或樹枝樣交錯排列,為增殖狀態(tài)的足細胞；在37℃無IFN-γ條件下培養(yǎng)10-14天后,足細胞分化成熟,胞體變大,胞質(zhì)變淡,呈云朵狀,分出許多初級及次級足突相互交錯,為分化狀態(tài)的足細胞；33℃ IFN

21、-γ培養(yǎng)條件下足細胞處于增殖狀態(tài),不表達足細胞特異性骨架蛋白synaptopodin；而37℃無IFN-γ條件下培養(yǎng)10天分化成熟后的足細胞表達足細胞特異性骨架蛋白synaptopodin,可見細胞內(nèi)拉絲狀細胞骨架。
　　 三、阿米洛利對足細胞活動力的影響
　　 (一)轉(zhuǎn)板遷移測定法(Transwell migration assay):
　　 在Con組、LPS組及LPS+amiloride組,平均每個視野細胞

22、數(shù)分別為(248.75±10.11)、(324.25±14.97)和(274.5±8.35)個,LPS組遷移細胞數(shù)明顯多于其他2組,有統(tǒng)計學意義(均P=0.000)。
　　 (二)刮除法(Wound healing assay):
　　 為了更直接的分析各實驗組足細胞的活動力改變情況,我們采用刮除法來檢測足細胞的損傷修復能力,結(jié)果發(fā)現(xiàn)24小時后劃痕內(nèi)正常對照組、LPS組及LPS+amiloride組分別為(15±4.74

23、)、(42.6±6.88)和(18.4±6.35)個,LPS組刮除后的足細胞細胞損傷修復比Con組和LPS+amiloride組明顯增加(均P=0.000),有統(tǒng)計學意義；而LPS+amiloride組與Con組相比無統(tǒng)計學意義(P=0.392)。
　　 四、阿米洛利對足細胞uPAR表達的影響
　　 (一)阿米洛利可以抑制LPS誘導小鼠短暫蛋白尿模型及5/6腎切除模型足細胞uPAR表達:
　　 1)阿米洛利可以抑

24、制兩種模型足細胞uPAR蛋白表達激光共聚焦顯微鏡觀察,在LPS誘導小鼠短暫蛋白尿模型上,Con組足細胞特異性骨架蛋白Synaptopodin主要表達于腎小球足細胞,uPAR廣泛存在于腎小管和小球,二者很少在腎小球足細胞上融合；而LPS組可見uPAR表達增加,熒光亮度較高,與足細胞特異性骨架蛋白Synaptopodin在腎小球足細胞上廣泛融合；在LPS+amiloride組明顯可見uPAR表達下調(diào),熒光亮度降低,與足細胞特異性骨架蛋白Sy

25、naptopodin在腎小球足細胞上融合減少。
　　 同樣在5/6腎切除模型上,NTX組可見uPAR表達增加,熒光亮度較高,與足細胞特異性骨架蛋白Synaptopodin在腎小球足細胞上廣泛融合；與NTX組相比,sham組及NTX+amiloride組,明顯可見uPAR表達下調(diào),熒光亮度降低,與足細胞特異性骨架蛋白Synaptopodin在腎小球足細胞上融合減少。
　　 2)阿米洛利可以抑制兩種模型PLAUR mRNA表

26、達在LPS誘導小鼠短暫蛋白尿模型上,與con組相比較,LPS組PLAUR mRNA表達明顯增高,(2.12±0.35 vs1.04±0.14,P=0.000),有統(tǒng)計學意義；與LPS組相比較,LPS+amiloride組PLAUR mRNA表達下調(diào)(2.12±0.35 vs1.30±0.22,P=0.000),有統(tǒng)計學意義。
　　 在5/6腎切除模型上,與sham組相比較,NTX組PLAUR mRNA表達明顯增高(9.74±1.

27、44 vs1.01±0.13,P=0.000),有統(tǒng)計學意義；與NTX組相比較,NTX+amiloride組PLAUR mRNA表達下調(diào)(9.74±1.44 vs5.01±1.36,P=0.000),有統(tǒng)計學意義。
　　 (二)體外實驗中,阿米洛利可以足細胞uPAR的表達
　　 1)阿米洛利對足細胞PLAUR mRNA的影響:定量PCR檢測足細胞PLAURmRNA表達,LPS組PLAUR mRNA顯著高于Con組(2.4

28、1±0.32 vs1.00±0.00,P=0.000)及LPS+amiloride組(2.41±0.32 vs1.33±0.21,P=0.01),有統(tǒng)計學意義。
　　 2)阿米洛利對足細胞uPAR蛋白的影響:利用免疫熒光共聚焦技術(shù)檢測各實驗分組足細胞uPAR蛋白表達,LPS組uPAR蛋白熒光信號明顯強于正常對照組和LPS+amiloride組,正常對照組與LPS+amiloride組熒光信號無明顯差異。采用流式細胞術(shù)檢測各組足細

29、胞uPAR蛋白表達,Con組、LPS組及LPS+amiloride組uPAR蛋白表達率分別為(10.34±3.25)％,(50.74±6.78)％及(29.97±10.26)％;LPS組uPAR蛋白表達率明顯高于Con組(P=0.001)及LPS+amiloride組(P=0.014),有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)論：
　　 一、在LPS誘導小鼠蛋白尿模型及5/6腎切除大鼠蛋白尿模型兩種經(jīng)典蛋白尿模型中,阿米洛利具有降低蛋白