miRNA-214-Ca2+信號(hào)通路在大鼠電針預(yù)處理心肌缺血-再灌注損傷保護(hù)中的作用.pdf

1、心血管疾病是發(fā)達(dá)國(guó)家導(dǎo)致死亡的主要疾病，僅在美國(guó)就影響著8千余萬(wàn)人的身體健康。其中心肌梗死、心臟手術(shù)、體外循環(huán)結(jié)束后發(fā)生的心肌缺血-再灌注(I/R)損傷的程度對(duì)上述心血管疾病預(yù)后至關(guān)重要。心肌缺血-再灌注損傷的分子機(jī)制十分復(fù)雜，現(xiàn)有的臨床預(yù)防與治療方法的效果不甚理想。
　　為進(jìn)一步揭示電針預(yù)處理的相關(guān)機(jī)制，此研究將研究重點(diǎn)放在了對(duì)心臟具有保護(hù)作用的miRNAs上。多項(xiàng)研究結(jié)果證實(shí)了一系列心臟應(yīng)激反應(yīng)中的敏感標(biāo)志物中包括miRNA-

2、214，在心臟肥大、心肌梗死和心臟衰竭時(shí)均發(fā)現(xiàn)有miRNA-214的表達(dá)上調(diào)。大鼠發(fā)生心肌缺血-再灌注時(shí)損傷時(shí)的內(nèi)源性心臟保護(hù)機(jī)制中，miRNA-214表達(dá)上調(diào)的機(jī)制為學(xué)者所發(fā)現(xiàn)和證實(shí)。結(jié)合上述研究結(jié)果，此研究假設(shè)miRNA-214參與介導(dǎo)了電針預(yù)處理對(duì)心肌缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用，擬系統(tǒng)地檢驗(yàn)電針預(yù)處理對(duì)在體和體外心肌缺血-再灌注損傷時(shí)的相關(guān)作用，以及電針預(yù)處理對(duì)心肌缺血-再灌注損傷發(fā)揮作用時(shí)是否有miRNA-214機(jī)制參與其中。本

3、文主要分為幾個(gè)部分：
　　第一部分：電針預(yù)處理對(duì)在體和離體心肌缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用
　　目的：評(píng)估電針預(yù)處理對(duì)在體和離體心肌細(xì)胞缺血-再灌注損傷時(shí)所發(fā)揮的相關(guān)作用。
　　方法:在體實(shí)驗(yàn)分組:雄性Sprague-Dawley大鼠24只隨機(jī)分為四組(n=6):假手術(shù)組（Sham組）、Sham+電針組（sham+EA）、缺血-再灌注組（I/R組）、缺血-再灌注+電針組（I/R+EA組）。在心肌缺血-再灌注損傷實(shí)驗(yàn)前3天

4、，每天對(duì)Sham+EA組、I/R+EA組的大鼠實(shí)施雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴持續(xù)電針刺激30min。
　　離體實(shí)驗(yàn)分組:將H9c2細(xì)胞隨機(jī)分為四組(n=3):Control組、Control+電針組（Control+EA組）、氧糖剝奪組（OGD組）、氧糖剝奪+電針組(OGD+EA組)。Control+EA組和OGD+EA組細(xì)胞在OGD前10天，每天給予50Hz，0.5ms，17.3V，持續(xù)刺激30min。對(duì)OGD組和OGD+EA組細(xì)胞經(jīng)氧-糖剝奪

5、(OGD)制作心肌細(xì)胞缺血-再灌注模型。
　　結(jié)果:再灌注180min時(shí)，Sham組、sham+EA組I/R組及I/R+EA組的HR、MAP、LVSP、±dp/dt max等心功能指標(biāo)監(jiān)測(cè)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，Sham組與sham+EA組大鼠的各項(xiàng)心功能指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴電針與微電流預(yù)處理可有效保護(hù)心臟對(duì)抗心肌缺血-再灌注損傷。
　　第二部分：miRNA-214介導(dǎo)了電針預(yù)處理

6、對(duì)心肌缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用
　　目的：評(píng)估電針預(yù)處理在體和離體心肌細(xì)胞的發(fā)揮心臟保護(hù)作用時(shí)，是否有miRNA-214和鈣超載相關(guān)機(jī)制參與其中。
　　方法：在體實(shí)驗(yàn)分組:雄性Sprague-Dawley大鼠24只隨機(jī)分為四組(n=6):假手術(shù)組（Sham組）、Sham+電針組（sham+EA）、缺血-再灌注組（I/R組）、缺血-再灌注+電針組（I/R+EA組）。在心肌缺血-再灌注損傷實(shí)驗(yàn)前3天，每天對(duì)Sham+EA組、I

7、/R+EA組的大鼠實(shí)施30min的雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴持續(xù)電針刺激。通過(guò)對(duì)I/R組及I/R+EA組大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支(LAD)結(jié)扎并行缺血40min，再灌注180min來(lái)制備心肌缺血-再灌注模型。Sham組接受上述相同手術(shù)操作，但未行LAD結(jié)扎。
　　結(jié)果：I/R組miRNA-214的表達(dá)高于sham組(P＜0.01)。sham+EA組和I/R+EA組的miRNA-214表達(dá)水平因電針預(yù)處理而有效上調(diào)。與Control組正常心肌細(xì)胞比較，

8、電針刺激的心肌細(xì)胞和OGD處理的心肌細(xì)胞的miRNA-214表達(dá)均上調(diào)（P＜0.01）。此外，OGD+EA組心肌細(xì)胞miRNA-214表達(dá)高于未經(jīng)電刺激的OGD組心肌細(xì)胞(P＜0.01)。Control組和OGD組經(jīng)電刺激后[Ca2+]i均下調(diào)(P＜0.05)。OGD處理細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i顯著高于對(duì)Con trol組，OGD+EA組細(xì)胞[Ca2+]i顯著低于OGD組，P＜0.01。OGD組NCX1、BIM、CaMKⅡδ和CypD等蛋白

9、濃度高于Control組，OGD+EA組上述指標(biāo)顯著低于OGD組，P＜0.05或P＜0.01。
　　結(jié)論：體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)電針和微電流預(yù)處理可通過(guò)上調(diào)miRNA-214表達(dá)，抑制OGD所致的Ca2+和NCX1、BIM、CaMKⅡδ和CypD等相關(guān)蛋白的升高，可在心肌缺血-再灌注時(shí)發(fā)揮有效的心臟保護(hù)作用。
　　第三部分：miRNA-214/Ca2+信號(hào)通路在電針預(yù)處理心肌缺血-再灌注損傷心肌保護(hù)中的作用和細(xì)胞分子機(jī)制

10、r>　　目的：通過(guò)對(duì)miRNA-214過(guò)表達(dá)和miRNA-214沉默模型相比較，來(lái)研究miRNA-214/Ca2+信號(hào)通路在電針預(yù)處理抗心肌缺血-再灌注損傷中的作用及其細(xì)胞分子機(jī)制。
　　方法：將H9c2細(xì)胞隨機(jī)分為4組(n=3):Sham組、氧糖剝奪組(OGD組)、氧糖剝奪+電針+ miRNA-214沉默組（miR-NC組）、氧糖剝奪+電針+miRNA-214過(guò)表達(dá)組（miR-214組）。利用miRNA-214慢病毒進(jìn)行基因轉(zhuǎn):

11、處理，利用miRNA-214前體慢病毒進(jìn)行基因沉默處理。在體外心肌缺血-再灌注模型構(gòu)建前10天，將miRNA-214慢病毒和miRNA-214前體慢病毒分別注入miR-214組和miR-NC組H9c2細(xì)胞，以制備miRNA-214過(guò)表達(dá)和基因沉默模型。miR-NC組和miRNA-214在OGD前10天，每天給予電刺激30min。對(duì)OGD組、miR-NC組、miR-214組細(xì)胞經(jīng)氧糖剝奪制作心肌細(xì)胞缺血-再灌注模型。
　　結(jié)果：sh

12、am組、OGD組、miR-NC組、miRNA-214組四組細(xì)胞凋亡率分別為9.86+3.98％、15.86±2.26％、46.99±4.41％、17.35±1.34％。Sham組中細(xì)胞凋亡不明顯，OGD組中有一定的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象發(fā)生，miRNA-214組中細(xì)胞凋亡情況略低于OGD組，miR-NC組細(xì)胞凋亡情況發(fā)生顯著高于其他各組。miRNA-214血漿LDH和CK活性低于miR-NC組(P＜0.01)。miRNA-214組miRNA-21

13、4 mRNA表達(dá)水平，較miR-NC組增加約3倍(P＜0.01)。miRNA-214組[Ca2+]i顯著低于miR-NC組(P＜0.05)。miRNA-214組NCX1、BIM、CaMKⅡδ和CypD等蛋白水平均顯著低于miR-NC組(P＜0.01)。
　　結(jié)論：miRNA-214/Ca2+信號(hào)通路參與電針預(yù)處理心肌缺血-再灌注損傷心肌保護(hù)中的作用和細(xì)胞分子機(jī)制。
　　1、體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)體內(nèi)雙內(nèi)關(guān)穴電針和體外微電流預(yù)