馬氏副球菌W10173基因組測(cè)序及其酰胺酶基因的克隆與表達(dá).pdf

1、酰胺酶可以將酰胺水解生成對(duì)應(yīng)的羧酸和氨，在醫(yī)藥、食品、紡織皮革加工等方面具有極其重要的作用。L-天冬酰胺酶廣泛被臨床上用于兒童急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）的治療；L-谷氨酰胺酶在谷氨酰胺分解過(guò)程中是關(guān)鍵酶和限速酶，與腫瘤的生長(zhǎng)、腫瘤血管的生成及腫瘤免疫都有重要的關(guān)系；立體專一性哌嗪-2-甲酰胺酶可以催化水解產(chǎn)生一種手性藥物中間體哌嗪-2-羧酸，其不同的單一對(duì)映體（R型和S型）衍生物具有多種不同的藥理學(xué)活性。本實(shí)驗(yàn)室在前期工作中篩選得到的

2、馬氏副球菌(Paracoccus marcusii)W10173可立體選擇性水解(R,S)-哌嗪-2-甲酰胺中的(S)-哌嗪-2-甲酰胺得到(S)-哌嗪-2-羧酸，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)基因組測(cè)序技術(shù)獲得馬氏副球菌W10173基因組，為了進(jìn)一步發(fā)掘菌株本身酰胺酶資源，分析得到5個(gè)酰胺酶基因并對(duì)其進(jìn)行克隆及異源表達(dá)，為酰胺酶的生產(chǎn)和應(yīng)用提供基礎(chǔ)。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴通過(guò)分析基因組測(cè)序，馬氏副球菌W10173編碼1個(gè)谷氨酰胺酶(PM150

3、9)、2個(gè)天冬酰胺酶(PM1383, PM3012)和2個(gè)潛在的哌嗪-2-甲酰胺酶(PM2486, PM3475)。PM1509, PM1383和PM3012成功克隆并構(gòu)建pET28-a(+)-X/BL21(DE3)原核重組表達(dá)載體，以IPTG為誘導(dǎo)劑，當(dāng)OD600約為0.6時(shí)，加入0.8 mmol/L IPTG，18℃誘導(dǎo)5 h，目的蛋白的表達(dá)量分別占蛋白表達(dá)總量的30.5％,23.8%,20.3%。但目的蛋白都以包涵體形式存在，經(jīng)超

4、聲破碎處理后將包涵體蛋白用Ni柱試劑盒純化，純化后蛋白的表達(dá)量分別為2.53 mg/mL,2.13 mg/mL,1.62 mg/mL，純化蛋白復(fù)性后蛋白的表達(dá)量分別為0.41 mg/mL,0.34 mg/mL,0.31 mg/mL，收率分別為16.2%,15.9%,19.1%。分別以L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺為底物采用TLC法測(cè)定復(fù)性后的酶蛋白活性，催化水解可以得到相應(yīng)的產(chǎn)物，證明PM1509表達(dá)的蛋白有L-谷氨酰胺酶酶活，PM1383

5、和PM3012表達(dá)的蛋白有L-天冬酰胺酶活性。⑵利用SOMPA軟件、PredictProtein數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)PM2486和PM3475基因進(jìn)行編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示β-折疊較少，而無(wú)規(guī)則卷曲較多且含有半胱氨酸可形成二硫鍵，這些因素導(dǎo)致了復(fù)性后的蛋白無(wú)活性的可能性較大，故選取巴斯德畢赤酵母GS115進(jìn)行真核表達(dá)。篩選得到的轉(zhuǎn)化子經(jīng)過(guò)驗(yàn)證大多數(shù)為甲醇利用快型，以甲醇為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，重組菌甲醇誘導(dǎo)表達(dá)后SDS-PAGE檢測(cè)目的