副球菌W10173(S)-酰胺酶的分離純化及其酶學性質(zhì)研究.pdf

1、酰胺酶可以將酰胺水解生成對應的羧酸和氨，其中的立體專一性酰胺酶能專一性水解某種對映體酰胺，是一種極有前途的用于獲取手性酰胺及其衍生物的工具。本實驗室篩選得到的副球菌 W10173產(chǎn)生的(S)-酰胺酶能夠立體選擇性水解(R,S)-哌嗪-2-甲酰胺中的(S)-哌嗪-2-甲酰胺生成重要醫(yī)藥中間體哌嗪-2-羧酸的單一對映體。
　　本研究首先對副球菌 W10173的(S)-酰胺酶分離純化方法進行了研究。通過對超聲波破碎條件、鹽析條件、DEA

2、E-52離子交換洗脫條件進行探索，確定了超聲波最佳破碎條件為功率400 W，工作時間3 s(間歇時間6 s)，循環(huán)270次；鹽析最佳硫酸銨飽和度范圍為20％-60％，且重復三次；DEAE-52離子交換層析洗脫液最佳 pH為7.0，流速為250 mL/cm2/hr，洗脫液依次為c(NaCl)0.25 mol/L100mL、c(NaCl)0.275mol/L60 mL、c(NaCl)0.30 mol/L60 mL、c(NaCl)0.325

3、mol/L60 mL、c(NaCl)0.35 mol/L60 mL、c(NaCl)0.375 mol/L60 mL。最后，(S)-酰胺酶純化倍數(shù)為428.3。經(jīng) SDS-PAGE檢測最終酶蛋白分子量約為37.6 kDa。
　　為建立該(S)-酰胺酶游離酶的最適作用條件，進一步對其酶學性質(zhì)進行了研究，確定了pH、溫度、金屬離子、EDTA-Na2、尿素等對酶活的影響。通過測定在不同 pH、不同溫度下(S)-酰胺酶酶活，確定了該(S)-

4、酰胺酶的最佳起始 pH為9.0、最佳反應溫度為37℃。同時還發(fā)現(xiàn)酶對環(huán)境 pH較為敏感，pH小于9或大于10.5都會導致酶活的迅速下降。通過對酶在40℃、60℃、80℃各5 h、10 h、15 h、20 h后殘留的酶活進行測定發(fā)現(xiàn)，該酶具有一定的溫度穩(wěn)定性，40℃條件下20 h后仍能保留近50％的活性。不同金屬離子對酶活的影響差異顯著，1 mmol/L或10 mmol/L的Ca2+，Zn2+、Ag+、Pb2+、Na+都能較強的抑制(S)