氯氮平及其代謝物的死后分布及死后彌散研究.pdf

1、目的:
　　 1.建立血液、尿液及組織中氯氮平(Clozapine，CLP)及主要代謝物去甲氯氮平（demethylclozapine，DMCLP）、氯氮平氮氧化物(N-oxidation-clozapine，CLP-NO)的固相萃取/液相色譜-質(zhì)譜(SPE-LC/MS)的檢測方法。
　　 2.研究CLP及其代謝物死后分布及死后彌散規(guī)律，為氯氮平中毒死亡案件的法醫(yī)學(xué)鑒定提供實驗依據(jù)。
　　 方法:
　　

2、1.氯氮平及其代謝物的SPE和LC/MS/MS分析:對檢材預(yù)處理后，采用OASIS(R)HLB3cc(60mg)固相萃取小柱對檢材進(jìn)行提取凈化，采用Agilent(R)XDB-C18液相柱（4.6mm×150mm×3.5um）作為液相色譜柱，進(jìn)行LC/MS/MS檢測。
　　 2.死后分布:新西蘭大白兔6只，雄性，隔夜禁食，隨機分成兩組，用氯氮平分別以LD50劑量(270mg/kg)與4LD50劑量(1080mg/kg)給實驗動物

3、（新西蘭大白兔）灌胃，待實驗動物心跳呼吸等生命體征全部消失后，迅速解剖動物，提取心血、尿、腦、心、肝、脾、肺、腎等檢材，冷凍保存，經(jīng)固相萃取后，LC/MS/MS定性定量檢測其中CLP及其代謝物(DMCLP和CLP-NO)的含量，定性檢測葡萄糖醛酸氯氮平(CLP-G)。
　　 3.死后彌散:新西蘭大白兔33只，雄性，隔夜禁食，隨機分為死后彌散組（15只），溫度影響組（6只），劑量影響組（6只）和灌胃時間影響組（6只）。
　　

4、 死后彌散組:將新西蘭大白兔固定于兔臺上，夾閉氣管處死，死后1h以LD50(270mg/kg)劑量CLP給實驗動物（新西蘭大白兔）灌胃染毒，染毒后實驗動物置于常溫條件下，分別于0.5d，1d，2d，4d，6d各解剖3只實驗動物，提取腦、心、肺、肝、腎、右下肢、玻璃體液、心血、尿、膽汁，-20℃保存，經(jīng)固相萃取后，LC-MS/MS定性定量檢測其中CLP及其代謝物(DMCLP和CLP-NO)含量，定性檢測葡萄糖醛酸氯氮平(CLP-G)。<

5、br>　　 溫度影響組:將新西蘭大白兔固定在兔臺上，夾閉氣管處死，死后1h以LD50(270mg/kg)劑量CLP給實驗動物（新西蘭大白兔）灌胃染毒，將染毒后實驗動物各三只分別置于-20℃，4℃及常溫條件下保存，4d后全部解剖，提取腦、心、肺、肝、腎、右下肢、玻璃體液、心血、尿、膽汁，檢材于-20℃保存，經(jīng)固相萃取后，LC-MS/MS定性定量檢測其中CLP及其代謝物(DMCLP和CLP-NO)含量，定性檢測葡萄糖醛酸氯氮平(CLP-G

6、)。
　　 劑量影響組:將新西蘭大白兔固定在兔臺上，夾閉氣管處死，死后1h分別以1/2LD50(135mg/kg)、LD50(270mg/kg)劑量CLP給實驗動物（新西蘭大白兔）灌胃染毒，將染毒后實驗動物置于常溫條件下，4d后解剖，提取腦、心、肺、肝、腎、右下肢、玻璃體液、心血、尿、膽汁，檢材于-20℃保存，后經(jīng)固相萃取，LC-MS/MS定性定量檢測其中CLP及其代謝物（DMCLP和CLP-NO）含量，定性檢測葡萄糖醛酸氯氮平

7、(CLP-G)。
　　 灌胃時間影響組:將新西蘭大白兔固定在兔臺上，夾閉氣管處死，于死后1h、3h、6h分別以LD50(270mg/kg)劑量CLP給實驗動物（新西蘭大白兔）灌胃染毒，將染毒后實驗動物置于常溫條件下，4d后解剖，提取腦、心、肺、肝、腎、右下肢、玻璃體液、心血、尿、膽汁，檢材于-20℃保存，經(jīng)固相萃取后，LC-MS/MS定性定量檢測其中CLP及其代謝物（DMCLP和CLP-NO）含量，定性檢測葡萄糖醛酸氯氮平(CL

8、P-G)。
　　 4.采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件處理實驗數(shù)據(jù)，結(jié)果以(x)±S表示。
　　 結(jié)果:
　　 1.氯氮平及其代謝物SPE-LC/MS/MS分析
　　 ①采用Agilent(R)DB-C18（4.6mm×150mm×3.5um）液相柱，前接phenomenex保護(hù)柱（DIKMA公司，美國）作為液相色譜柱，目標(biāo)物出峰最宜;血、尿及組織樣品中加入適量2.5moL/L碳酸鈉調(diào)PH至11時目標(biāo)物回收率

9、最佳;采用OASIS(R)HLB3cc(60mg)柱固相萃取進(jìn)行提取，較液液萃?。ㄒ宜嵋阴ィ┨崛』厥章矢?。
　　 ②液相色譜/質(zhì)譜檢驗(LC/MS):使用電噴霧正離子源㈩，采用多反應(yīng)監(jiān)測MRM掃描方式，MRM監(jiān)測各組分離子對進(jìn)行定性，氯氮平的定量離子對(327/192)，去甲氯氮平(313/270.2)，氯氮平-N-氧化物(343/243.1)，葡萄糖醛酸氯氮平(503/327)，安定(313/154.1)，尿液中CLP、DCL

10、P、CLP-NO的線性檢測范圍為5或10-1000 ng/mL，最低檢測濃度分別為5或10 ng/mL;血液中CLP、DCLP、CLP-NO的線性檢測范圍為2或5-1000 ng/mL，最低檢測濃度為2或5ng/mL;肝中CLP、DCLP、CLP-NO的線性檢測范圍為50-1000ng/mL，最低檢測濃度為50ng/mL。
　　 2.死后分布
　　 LD50組及4LD50組染毒致死家兔體液和組織中均檢出CLP、DMCLP

11、和CLP-NO，尿液中均檢出CLP-G，其余組織和體液中未檢出CLP-G。
　　 LD50灌胃組:CLP含量從高到低分別為:肺＞肝、腎、腦、脾＞膽汁、心肌、心血＞尿、玻璃體液、下肢肌;DMCLP在各臟器的含量從高到低分別為肺、肝＞腎、腦、脾＞膽汁、心肌、心血、尿、玻璃體液＞下肢肌;CLP-NO在各臟器的含量從高到低分別為肺、肝＞腎、腦、脾＞膽汁、心肌、＞心血、尿、玻璃體液、下肢肌。
　　 4LD50灌胃組:CLP含量從高

12、到低分別為:肺、肝＞腎、腦、脾＞膽汁、心?。拘难?、尿、玻璃體液、下肢肌; DMCLP含量從高到低分別為肺、肝＞腎、腦、脾＞心肌、膽汁、心血、尿、玻璃體液＞下肢肌;CLP-NO含量從高到低分別為肺、肝＞腎、腦、心?。酒?、膽汁、心血、玻璃體液、尿＞下肢肌。
　　 3.死后彌散
　　 死后彌散動物模型中，所有檢材中均未檢出氯氮平代謝物。
　　 死后彌散組:LD50染毒家兔死后常溫保存時，0.5 d后心肌、心血、肺、肝、

13、腎均檢CLP，1d后腦、下肢肌中也檢測出CLP，2d后膽汁也檢出CLP，玻璃體及尿液一直未檢出CLP。
　　 溫度影響組:-20℃組肝、脾、肺中均檢出CLP，其余均未檢出CLP;4℃組心、肝、脾、肺、腎、腦均檢出CLP;常溫組除尿、玻璃體液未檢出CLP外，其余均檢出CLP。
　　 劑量影響組:1/2LD50、LD50、2LD50三種劑量下，尿、下肢肌均未檢出CLP，心肌中CLP的濃度隨著灌胃藥物濃度的增大而增大。

14、　　 灌胃時間影響組:1h組尿、玻璃體液中未檢出CLP;3h組尿、玻璃體液、下肢肌中未檢出CLP;6h組尿、玻璃體液、下肢肌、心、腎中未檢出CLP，各組其余組織和體液中均檢出CLP。
　　 結(jié)論:
　　 1.本文建立同時測定生物檢材中CLP、CLP、DMCLP和CLP-NO定性、定量及CLP-G定性的SPE-LC/MS/MS檢測法，回收率高，重現(xiàn)性好，特異性高，靈敏度高，適用于臨床中毒的快速檢驗和法醫(yī)中毒案件的檢驗。<

15、br>　　 2.CLP及其代謝物在染毒致死家兔體內(nèi)分布不均勻。LD50組及4LD50組染毒致死家兔體液和組織中均檢出CLP、DMCLP和CLP-NO，尿液中均檢出CLP-G，其余組織和體液中未檢出CLP-G。
　　 3.本實驗再次證明CLP在家兔體內(nèi)可發(fā)生死后彌散，保存時間、保存溫度和灌胃時間可影響其死后彌散，同時發(fā)現(xiàn)6d內(nèi)所有死后染毒家兔體內(nèi)均未檢出CLP的代謝物DMCLP、CLP-NO和CLP-G。
　　 4.比較