T-2-HT-2毒素對(duì)肉雞毒性機(jī)理及其減控作用研究.pdf

1、T-2毒素(T-2)與HT-2毒素(HT-2)均屬于A類單端孢霉烯族毒素，為梨孢鐮刀菌次級(jí)代謝產(chǎn)物。T-2/HT-2在自然界中廣泛分布，攝入體內(nèi)可對(duì)人畜健康造成損傷，在各組織器官中殘留，并導(dǎo)致動(dòng)物發(fā)生氧化應(yīng)激與細(xì)胞凋亡。肉雞對(duì)T-2較敏感，低劑量毒素便可產(chǎn)生毒性作用，引起其采食量下降、口腔損傷、消化道潰瘍及體重減輕等。在肉雞飼喂過程中向飼料中添加物理性吸附劑可有效防止毒素對(duì)肉雞的損害。T-2可導(dǎo)致細(xì)胞活性降低、死亡率增高，發(fā)生氧化應(yīng)激和

2、細(xì)胞凋亡。目前，研究T-2/HT-2對(duì)動(dòng)物的毒性作用報(bào)道較少，而且尚無相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道兩種毒素對(duì)肉雞體內(nèi)、體外的毒性作用。因此，本文主要從體內(nèi)、體外兩方面研究T-2/HT-2對(duì)肉雞的毒性機(jī)理及減控作用。首先建立了一種可檢測(cè)肉雞體內(nèi)T-2/HT-2的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)方法，隨后采用梨孢鐮刀菌接種玉米獲得發(fā)霉玉米作為毒素來源，研究肉雞自由采食發(fā)霉玉米后毒性作用及在體內(nèi)的殘留情況。由于肝是T-2產(chǎn)生毒性作用的靶器官，因此，體

3、外試驗(yàn)選擇肝細(xì)胞作為研究對(duì)象。通過灌流法分離獲得原代雞肝細(xì)胞，研究T-2/HT-2對(duì)肝細(xì)胞的毒性與細(xì)胞凋亡相關(guān)機(jī)理。然后，通過向細(xì)胞培養(yǎng)基中添加有機(jī)硒，研究其對(duì)細(xì)胞毒性與氧化應(yīng)激的減控作用。最后，向發(fā)霉飼料中添加蒙脫土，研究其對(duì)T-2/HT-2產(chǎn)生毒性的減控作用。
　　首先建立一種檢測(cè)肉雞體內(nèi)T-2與HT-2的方法，即利用HPLC-MS/MS檢測(cè)心、肝、脾、肺、腎、腺胃、肌胃、小腸、肌肉、骨骼及腦中T-2/HT-2的含量。該方法利

4、用乙酸乙酯萃取毒素，然后用C18反相柱（50×2.1 mm，3μm）分離毒素，最后質(zhì)譜儀在正離子模式(ESI+)下分析毒素。該方法檢測(cè)限(LOD)為0.02～0.05μg·kg-1，定量限(LOQ)為0.08～0.15μg·kg-1;樣品回收率為58.5～110.5％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于17.0％;基質(zhì)效應(yīng)(Matrix effect，ME)為33.3～124.9％，RSD小于17.1％。日內(nèi)、日間精密度及樣品穩(wěn)定性RSD均低于

5、14.7％。
　　然后用梨孢鐮刀菌接種獲得發(fā)霉玉米，檢測(cè)霉玉米中相關(guān)毒素含量。根據(jù)玉米中T-2含量，將發(fā)霉玉米以不同比例與正常飼料混合，分為對(duì)照組（正常飼料）、低劑量組(1mg·kg-1 T-2)、中劑量組（2 mg·kg-1 T-2）及高劑量組(4 mg·kg-1 T-2)，1日齡肉雞自由采食42 d。檢測(cè)各組肉雞的生理指標(biāo)、生化指標(biāo)、病理變化、骨計(jì)量指標(biāo)、毒素殘留及氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡相關(guān)mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示:與對(duì)照組比較，

6、毒素組肉雞體重顯著下降，增重降低，料肉比(FCR)顯著升高(P＜0.05)。血清中堿性磷酸酶(ALP)、谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)與天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)顯著升高，總蛋白(TP)顯著降低（P＜0.05）。股骨與脛骨密度、剛度、彎曲的楊氏模量及最大載荷顯著下降（P＜0.05）。T-2/HT-2在肉雞各組織器官中不同程度殘留。肝氧化應(yīng)激與細(xì)胞凋亡相關(guān)mRNA表達(dá)也顯著上調(diào)（P＜0.05）。隨后用不同劑量的T-2/HT-2處理灌流法分

7、離的原代雞肝細(xì)胞。通過測(cè)定細(xì)胞活性（MTT法）、細(xì)胞形態(tài)（蘇木素-伊紅染色）及ALT/AST活性評(píng)價(jià)毒素產(chǎn)生的細(xì)胞毒性作用。T-2/HT-2會(huì)引起細(xì)胞凋亡，在熒光顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞（Hoechst33342染色及TUNEL法），并測(cè)定細(xì)胞凋亡率和凋亡時(shí)期（AnnexinⅤ-FITC與PI雙染色法）;然后用50 nM T-2/HT-2與肝細(xì)胞孵育不同時(shí)間，檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白(Caspases-3、Caspases-7、Caspases

8、-9、P53、Bcl-2、Bax)在基因水平（熒光定量PCR）與蛋白水平（蛋白質(zhì)印跡技術(shù)）的相對(duì)表達(dá)量。與對(duì)照組相比，毒素組細(xì)胞活性顯著降低(P＜0.05)，細(xì)胞體積與數(shù)量減少，死亡細(xì)胞數(shù)增加，培養(yǎng)基中ALT/AST活性顯著增強(qiáng)(P＜0.05);凋亡細(xì)胞顯著增加，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P＜0.05)，肝細(xì)胞凋亡多為早期凋亡。50 nM T-2/HT-2處理細(xì)胞后，凋亡相關(guān)基因與蛋白發(fā)揮作用的時(shí)期集中在細(xì)胞染毒后0～24 h之間。與0h細(xì)胞

9、相比，不同時(shí)間點(diǎn)Bax、Caspases-3、Caspases-7、Caspases-9及P53基因相對(duì)表達(dá)量均表現(xiàn)不同程度上調(diào)(P＜0.05)，而Bcl-2基因相對(duì)表達(dá)量無顯著差異(P＞0.05)。在0～24 h之間，Bax、Caspases-3、Caspases-7、Caspases-9及P53蛋白表達(dá)量均隨時(shí)間推移顯著上調(diào)(P＜0.05)，而Bcl-2表達(dá)量隨時(shí)間推移顯著下調(diào)(P＜0.05)。
　　不同劑量T-2/HT-2與

10、原代肝細(xì)胞共孵育24 h，并向肝細(xì)胞培養(yǎng)液中添加DL-硒代蛋氨酸，通過測(cè)定細(xì)胞活性（MTT法）、乳酸脫氫酶(LDH)漏出率評(píng)價(jià)DL-硒代蛋氨酸對(duì)肝細(xì)胞損傷的減控作用。隨后測(cè)定細(xì)胞中活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、超氧化物歧化酶(SOD)及過氧化氫酶(CAT)水平，檢測(cè)谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)、GSH-PX、SOD及CAT mRNA相對(duì)表達(dá)量，評(píng)估DL-硒代蛋氨酸對(duì)氧化應(yīng)激減

11、控作用。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，毒素組細(xì)胞活性顯著下降，LDH漏出率顯著升高， ROS及MDA水平顯著上升，細(xì)胞內(nèi)GSH含量顯著下降，而胞內(nèi)抗氧化酶（GSH-PX、SOD及CAT）活性顯著升高，氧化應(yīng)激相關(guān)mRNA（GST、GSH-PX、SOD及CAT）表達(dá)量顯著提高（P＜0.05）。與相應(yīng)劑量的毒素組比較，試驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)基添加DL-硒代蛋氨酸，可顯著增加肝細(xì)胞活性，降低LDH漏出率，減少胞內(nèi)ROS和MDA水平，提高GSH、GSH-PX

12、、SOD及CAT水平，且氧化應(yīng)激相關(guān)mRNA表達(dá)量顯著上調(diào)(P＜0.05)。通過T-2體外吸附試驗(yàn)，確定蒙脫土是對(duì)T-2吸附率最高的吸附劑，以5g·kg-1的比例添加入霉飼料中，評(píng)價(jià)蒙脫土對(duì)T-2/HT-2毒性的減控作用。將肉雞分為對(duì)照組、脫毒對(duì)照組(5g·kg-1蒙脫土)、毒素組(4mg·kg-1 T-2)與脫毒組（4 mg·kg-1 T-2+5g·kg-1蒙脫土）。1日齡肉雞自由采食42 d，檢測(cè)肉雞的生理及生化指標(biāo)、病理變化、骨計(jì)

13、量指標(biāo)、毒素殘留及氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡相關(guān)mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示:與毒素組比較，飼料中添加蒙脫土脫毒組肉雞體重、增重、采食量、骨密度、骨剛度、彎曲的楊氏模量及最大載荷均顯著升高(P＜0.05)，F(xiàn)CR、ALP、AST、ALT以及氧化應(yīng)激與細(xì)胞凋亡相關(guān)mRNA均顯著降低(P＜0.05）。而且脫毒組肉雞體內(nèi)各器官中T-2/HT-2含量明顯低于毒素組相應(yīng)器官中的毒素含量(P＜0.05)。
　　結(jié)論:本文建立的HPLC-MSMS檢測(cè)方法，

14、可快速、有效檢測(cè)組織器官中T-2/HT-2殘留;同時(shí)可將該方法進(jìn)行推廣，作為檢測(cè)肉雞畜產(chǎn)品中毒素檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法。肉雞采食梨孢鐮刀菌污染的玉米后，霉玉米中的T-2/HT-2可導(dǎo)致肉雞產(chǎn)生各方面的毒性作用，并在肉雞體內(nèi)殘留，還可誘導(dǎo)肉雞肝臟氧化應(yīng)激與細(xì)胞凋亡。隨后，選擇肝作為體外研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)T-2/HT-2可造成肉雞肝細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且凋亡相關(guān)基因與蛋白在細(xì)胞凋亡機(jī)制中發(fā)揮重要作用。T-2/HT-2還可誘導(dǎo)肝細(xì)胞出現(xiàn)氧化