綿羊痘病毒E3L蛋白與Hela細胞內(nèi)PKR互作的初步研究.pdf

1、綿羊痘病毒(Sheeppox virus，SPPV)引起的綿羊痘發(fā)病癥狀和人類的天花很像，又稱“羊天花”。目前SPPV的致病機制和機體的免疫機制研究都不清楚。痘病毒的病毒生物學(xué)特征及致病機制都主要參考模式病毒痘苗病毒(Vaccinia virus，VACV)。雙鏈RNA蛋白激酶(doublestranded RNA-dependent protein kinase，PKR)是宿主抗病毒通路的關(guān)鍵分子之一，而大量研究表明，痘苗病毒編碼的E

2、3L蛋白可通過直接或間接與PKR相互作用并抑制PKR磷酸化。SPPV基因組中存在一個與VACV E3L基因序列高度相似的同源基因，但是關(guān)于SPPV K3L基因的研究較少，其具體的功能也尚不清楚。因此，本論文初步研究了SPPV E3L蛋白與宿主PKR的相互作用。首先我們建立分析檢測SPPV的基因組的熒光定量的方法，結(jié)果表明，該方法具有特異性強、靈敏度高（檢測下限為101 copies/μL）、重復(fù)性好（組內(nèi)組間重復(fù)性試驗的變異系數(shù)均小于3

3、％）的特點，可以用于臨床樣品的檢測。然后我們對實驗室分離保存的SPPV進行病毒滴度進行了測定，并繪制本研究所使用SPPV一步生長曲線，結(jié)果顯示，在接種0～12h病毒拷貝數(shù)幾乎沒變化，在12～72h病毒呈對數(shù)擴增，84h后進入平臺期。通過Western-blot方法檢測不同時間點SPPV感染Hela細胞后細胞內(nèi)PKR及其下游分子的活化水平，結(jié)果表明:SPPV感染引起的PKR及其下游分子的活化存在時間依賴性。然后通過免疫共沉淀和細胞中瞬時表

4、達E3L蛋白來研究E3L與PKR的互作關(guān)系;為了驗證SPPV-E3L蛋白對PKR-eIF2α磷酸化的影響以及關(guān)鍵功能位點的確定，本研究構(gòu)建了SPPV-E3L、SPPV-mE3L(基于SPPV-E3L在135、168和174位點的定點突變)、VACV-E3L和ORFV-E3L的真核表達載體并在Hela細胞中進行瞬時表達。本研究表明SPPV-E3L蛋白不能抑制Hela細胞中的PKR的磷酸化，135、168和174位3個關(guān)鍵位點的突變可能影響

5、了這一功能。在Hela細胞中瞬時表達VACV-E3L蛋白能提高SPPV的增殖水平。免疫沉淀試驗確定4種蛋白都能與PKR有物理相互作用;VACV-E3L、ORFV-E3L和SPPV-mE3L蛋白能夠抑制Hela細胞內(nèi)PKR的磷酸化，而SPPV-E3L蛋白不能抑制PKR磷酸化。瞬時表達VACV-E3L蛋白能夠影響SPPV的復(fù)制。最后，本論文還利用Crispr/Cas9技術(shù)建立PKR基因敲除的Hela細胞系，并獲得了PKR基因敲除的Hela細