登革病毒prM基因片段dsRNA介導的細胞內免疫的初步研究.pdf

1、登革熱(DengueFever,DF)是登革病毒(DengueVirus，DENV)感染引起的急性傳染病，是世界上廣泛傳播的蟲媒病毒性疾病之一。其主要傳播媒介是埃及伊蚊(Aedesaegypti)和白紋伊蚊(Aedesalbopictus)?？刂泼浇橐廖檬欠乐蜠F最有效的方法，然而傳統(tǒng)上控制媒介的措施有許多局限導致防治效果下降，如抗藥性增強，環(huán)境污染，成本太高等。以現(xiàn)代分子生物學為基礎的轉基因技術的出現(xiàn)為蚊媒疾病的防治提供了一個新的途徑

2、。轉基因蚊蟲研究的最重要的一步是研制出抗性因子。RNA干擾(RNAinterference，RNAi)作為近年來研究的熱門，已被廣泛地應用到各個醫(yī)學領域，包括基因功能研究，抗病毒治療等。在蚊細胞內引入登革病毒的雙鏈RNA能使蚊細胞對登革病毒在細胞內的增殖產生抗性，即細胞內免疫(intracellularimmunization)。構建能在蚊蟲體內轉錄登革病毒的雙鏈RNA的重組載體是其中關鍵的一步。 本研究根據登革Ⅱ型病毒NGC株

3、prM基因的部分序列設計2對引物，第1對與第2對引物僅上游引物引入的酶切位點不同。以感染登革Ⅱ型病毒的白紋伊蚊C6/36細胞提取的總RNA為模板，用RT-PCR的方法擴增約400bp大小的prM基因片段。將PCR產物用T-A克隆的方法插入到pMD18-T載體，得到pMDa和pMDb重組質粒。通過雙酶切鑒定和測序表明，所克隆的序列為登革Ⅱ型病毒prM基因序列。與登革病毒Ⅱ型NGC株相比，prM基因片段(去掉兩端部分引物的序列)的同源性為9

4、9％，387個堿基中有兩個堿基不同，分別是第132位A變?yōu)镚，編碼的氨基酸沒有變，第166位T變?yōu)镃，編碼的氨基酸由F變?yōu)長。將pMDb以KpnⅠ和BamHⅠ雙酶切得到的小片段插入到pMDa質粒上，得到具有prM基因正向序列和反向重復序列串聯(lián)結構的重組質粒pMD-prm-irprm.再將prm-irprm串聯(lián)結構以HindⅢ和SacⅠ雙酶切，并亞克隆到昆蟲表達載體pIEx-1上，構建成重組質粒pIE-prm-irprm.將pMDb以Kp

5、nⅠ和PstⅠ雙酶切得到的小片段插入到pIEx-1上，構建重組質粒pIE-irpm作為對照質粒之一。雙酶切鑒定和測序表明載體構建成功。在轉染之前，所有轉染用的質粒用QIAGEN的EndoFreePlasmidMaxiKit質粒抽提試劑盒抽提。將重組質粒和各對照質粒用脂質體Cellfectin轉染白紋伊蚊C6/36細胞，再用登革Ⅱ型病毒和Ⅰ型病毒感染細胞，觀察免疫效果。通過對照組質粒pIE-irprm的RT-PCR檢測表明轉染成功，且pI

6、E-irprm能在C6/36細胞內轉錄。通過TCID50測定病毒的滴度，描繪滴度隨時間的變化曲線，表明轉染pIE-prm-irprm的細胞感染的登革病毒的滴度比對照組plE-irprm，pIEx-1和空細胞的低。 這些研究表明：以RT-PCR擴增目的片段，利用T載體及其限制酶切位點亞克隆構建轉錄登革病毒發(fā)夾狀dsRNA的方法簡單可行；IE1啟動子及其上游的hr5增強子結構在C6/36細胞內有活性；轉染pIE-prm-irprm的