綿羊痘病毒和山羊痘病毒雙重PCR檢測方法的建立.pdf

1、羊痘是由山羊痘病毒屬病毒中的綿羊痘病毒(Sheeppoxvirus,SPPV)和山羊痘病毒(Goatpoxvirus,GTPV)所引起的羊的一種高度急性、熱性、接觸性傳染病,臨床上以發(fā)熱、皮膚出現(xiàn)痘疹、水泡或結(jié)節(jié)為主要特征。羊痘是所有動物痘病中最為嚴(yán)重的一種,發(fā)病率為50%～80%,病死率達(dá)20%～80%,其中羔羊病死率可達(dá)100%,導(dǎo)致妊娠羊流產(chǎn),繁殖力下降,羊毛和羊皮品質(zhì)嚴(yán)重受損.給養(yǎng)羊業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前.羊痘已遍布世界大

2、部分的國家和地區(qū),以非洲、亞洲最為嚴(yán)重,我國多地也均有發(fā)生,有的地區(qū)呈暴發(fā)流行,并有上升趨勢。此外,還存在一定的公共衛(wèi)生安全問題。通常認(rèn)為羊痘的感染具有宿主特異性,但越來越多的研究表明,SPPV和GTPV的某些毒株具有交叉感染性。綿羊痘和山羊痘具有十分相似的臨床癥狀和發(fā)病機(jī)理,與副痘病毒引起的病癥也有相似之處,有的病例發(fā)生繼發(fā)感染或與其他疾病混合感染,通過臨床特征很難診斷。羊痘病毒的分離培養(yǎng)和電鏡觀察特異性較強(qiáng),但耗時冗長,需要專業(yè)儀器

3、和技術(shù),不適于快速診斷和基層應(yīng)用的要求。血清學(xué)檢測方法相對簡便,但機(jī)體感染羊痘主要引起細(xì)胞免疫,僅產(chǎn)生較低水平的中和抗體,且SPPV、GTPV、牛疙瘩皮膚病毒(Lumpyskindiseasevirus,LSDV)及副痘病毒間存在共同的抗原和相似血清型,因而血清學(xué)檢測方法的靈敏度和特異性不高,亦不能相互鑒別診斷。因此,建立一種快速、簡捷、準(zhǔn)確的且能同時榆測綿羊痘和山羊痘的方法,對羊痘的早期診斷、疫情監(jiān)控、流行病學(xué)調(diào)查及早日消除羊痘等具有

4、重要意義。
　　 為保障養(yǎng)羊業(yè)健康發(fā)展,加快現(xiàn)代畜牧業(yè)前進(jìn)步伐,本研究從分子生物學(xué)出發(fā),以PCR方法為技術(shù)基礎(chǔ),建立了一種鑒別診斷SPPV和GTPV的以重PCR檢測辦法,主要研究內(nèi)容包括以下幾個方面:
　　 1、通過對GenBank中發(fā)表的SPPV和GTPV的全基因組序列進(jìn)行分析,應(yīng)用PrimerPremier5.0生物學(xué)軟什設(shè)計出兩對引物進(jìn)行PCR反應(yīng),將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化后連接到pMD19-T載體,構(gòu)建質(zhì)粒pM

5、D19-S和pMD19-G,質(zhì)粒測序結(jié)果與GenBank中發(fā)表的基因組序列進(jìn)行比對,結(jié)糶表明,兩對引物能特異性地擴(kuò)增出目的片段,pMD19-S與SPPV基因組序列的相似性在98%以上,pMD19-G與GTPV基因組序列的相似性為96%。
　　 2、通過對PCR反應(yīng)體系中引物濃度、TaqDNA聚合酶濃度和退火溫度的優(yōu)化,建立了SPPV單重PCR檢測方法和GTPV單重PCR檢測方法。特異性試驗結(jié)果表明:各單重PCR方法僅對日的基因有

6、擴(kuò)增,對其他病原或健康組織無擴(kuò)增。靈敏度試驗結(jié)果表明:SPPV單重PCR檢測方法最低可檢測到3.45×106copies/μL的SPPV質(zhì)粒DNA,GTPV單重PCR檢測方法最低可檢測到3.42×103copjes/μL的GTPV質(zhì)粒DNA。
　　 3、在已建立的SPPV單重PCR方法和GTPV單重PCR方法的基礎(chǔ)上,通過對PCR反應(yīng)體系中引物濃度、dNTP濃度,Mg2+濃度和退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。建立了單管同時擴(kuò)增SPPV和GTP

7、V的雙重PCR方法。特異性試驗結(jié)果表明:該方法能特異性擴(kuò)增SPPV長度為177bp和GTPV長度為222bp的目的片段,對其他病原或健康組織無擴(kuò)增。靈敏度試驗結(jié)果表明:該方法最低可檢測到1.725×107copies/μL的SPPV質(zhì)粒DNA和1.71×106copies/μL的GTPV質(zhì)粒DNA。
　　 4、分別采用病毒分離、綿羊痘和山羊痘單重PCR和雙重PCR方法對采自甘肅與重慶地區(qū)的50份疑似羊痘病料進(jìn)行檢測,其陽性檢出率

8、分別為14%、4%、10%、14%。試驗表明:雙重PCR能區(qū)別診斷綿羊痘和山羊痘,具有更高的特異性,優(yōu)于病毒分離培養(yǎng)方法;單重PCR方法與雙重PCR的符合率為100%,單重的PCR可以用于對雙重PCR擴(kuò)增結(jié)果的驗證。雙重PCR方法簡便、快速、具有高靈敏度和特異性,可以用于臨床樣品的檢測。
　　 總之,本研究建立的雙重PCR診斷方法能對綿羊痘病毒和山羊痘病毒單個或混合感染的病毒樣品進(jìn)行快速診斷,不僅對羊痘的臨床檢測提供了科學(xué)的理論