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1、羊痘是由羊痘病毒(CPV)感染山羊、綿羊或牛等偶蹄動(dòng)物引起的一種烈性傳染病,病畜以發(fā)熱、全身起痘為典型特征。本病世界范圍分布,是目前最嚴(yán)重的動(dòng)物痘病毒病。羊痘病毒基因組較大,有表達(dá)多個(gè)外來(lái)基因的潛力,自然條件下只感染牛羊等反芻類(lèi)動(dòng)物,而對(duì)人和其它哺乳動(dòng)物無(wú)傳染性,是牛、羊等重大傳染病重組活疫苗的理想載體。我國(guó)目前使用的山羊痘雞胚化弱毒疫苗的實(shí)踐證明有很好的免疫保護(hù)效果,以此構(gòu)建山羊痘活疫苗載體具有良好的前景。 本研究的目的是以我
2、國(guó)廣泛使用的山羊痘弱毒(GTPV)疫苗株G14-STV44-55為模板,通過(guò)基因重組等方法構(gòu)建新型的山羊痘病毒表達(dá)載體。本研究選擇CPV的三個(gè)可能的復(fù)制非必需區(qū),以VV I1L或VV P11為調(diào)控外源基因的啟動(dòng)子,以GPT為報(bào)告基因,構(gòu)建CPV轉(zhuǎn)移載體,并與親本病毒G14-STV44-55株重組,篩選重組的GTPV突變株。將用于重組病毒篩選的VV 7.5K啟動(dòng)子調(diào)控的gpt基因從PLSEG質(zhì)粒上切下,并克隆測(cè)序鑒定其正確后作為報(bào)告基因,
3、選用兩種痘苗病毒啟動(dòng)子VV I1L和VV P11,用OVERLAPE PCR的方法與報(bào)告基因GPT上7.5K啟動(dòng)子方向相背的連接起來(lái),形成啟動(dòng)子GPT復(fù)合DNA片段,構(gòu)成表達(dá)載體的調(diào)控和指示系統(tǒng),再克隆到PGM-T載體中測(cè)序鑒定其正確性。 本研究查閱相關(guān)文獻(xiàn),從中選取CPV可能的三個(gè)復(fù)制非必需區(qū):胸苷激酶(TK)基因,γ干擾素受體(γ-IFNR)基因和核糖核酸還原酶(RR)基因。根據(jù)基因BANK公布的羊痘病毒基因組序列設(shè)計(jì)引物,
4、使非必需區(qū)兩側(cè)各有800-1000bp側(cè)翼序列。以我國(guó)GTPV疫苗株G14-STV44-55為模板PCR擴(kuò)增目的基因及其側(cè)翼序列,并克隆到PGM-T載體中測(cè)序,然后將已經(jīng)構(gòu)建的啟動(dòng)子一報(bào)告基因復(fù)合DNA片段分別插入非必需區(qū)的Acc65 I,Pme I和BglII中,得到6個(gè)分別以TK基因,IFNR基因和RRASE基因?yàn)閭?cè)翼、以痘苗病毒VV I1L和VV P11為調(diào)控外源基因的啟動(dòng)子、以VV7.5K啟動(dòng)子調(diào)控的GPT為報(bào)告基因的表達(dá)載體:
5、PGM-TK-I1L-GPT,PGM-TK-P11-GPT,PGM-IFNR-P11-GPT,PGM-IFNR-I1L-GPT,PGM-RR-I1L-GPT,PGM-RR-P11-GPT。采取3-5月齡的臨床健康的綿羊睪丸,用胰酶消化法培養(yǎng)睪丸原代細(xì)胞。將構(gòu)建的六種轉(zhuǎn)移載體分別利用脂質(zhì)體Liposome2000轉(zhuǎn)染GTPV疫苗株G14-STV44-55感染的綿羊睪丸細(xì)胞,37℃5%CO2培養(yǎng)至出現(xiàn)CPE,收獲病毒,并以霉酚酸,氨基喋呤為
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