低產(chǎn)尿素葡萄酒酵母菌株的構(gòu)建.pdf

1、氨基甲酸乙酯（簡稱EC）是一種潛在致癌物，在許多發(fā)酵酒中均存在，其主要來源于發(fā)酵過程中酵母代謝產(chǎn)生的尿素。為了控制葡萄酒中EC的含量，本研究從阻斷尿素的來源（敲除分解精氨酸為尿素和鳥氨酸的精氨酸酶基因CAR1），促進尿素的分解(過表達分解尿素為NH3和CO2的尿基酰胺酶基因DUR1,2)和加快酵母細胞對發(fā)酵液中尿素的吸收（過表達尿素轉(zhuǎn)運蛋白Dur3p基因DUR3）三方面著手，主要研究內(nèi)容如下:
　　(1)以二倍體釀酒酵母WY-1為

2、出發(fā)菌株，分別構(gòu)建了一個CAR1等位基因單敲除和兩個CAR1等位基因雙敲除突變株YZ11和YZ22。CAR1基因轉(zhuǎn)錄水平的分析及葡萄酒發(fā)酵試驗表明，突變菌株YZ11與出發(fā)菌株相比，CAR1基因表達量降低了63％，尿素含量降低了14.56％，EC含量降低了23.71％，并且常規(guī)指標無明顯變化;突變菌株YZ22與出發(fā)菌株相比，CAR1基因表達量幾乎為0，尿素含量降低了77.89％，EC含量降低了73.78％，基因改造使菌株發(fā)酵速度變慢，且發(fā)

3、酵葡萄酒中精氨酸含量升高，脯氨酸含量降低，其他常規(guī)指標無明顯變化。
　　(2)以二倍體釀酒酵母WY-1為出發(fā)菌株，分別構(gòu)建了過表達轉(zhuǎn)化子WY-DUR1，2和WY-DUR3。葡萄酒發(fā)酵試驗表明，菌株WY-DUR1，2與出發(fā)菌株相比，尿素的含量降低了51.88％，EC含量降低了45.81％，并且常規(guī)指標無明顯變化;菌株WY-DUR3與出發(fā)菌株相比，尿素含量降低了54.54％，EC含量降低了48.16％，并且常規(guī)指標無明顯變化。

4、　　(3)構(gòu)建了敲除CAR1基因同時過表達DUR1，2基因的突變株CD1，2。對DUR1，2基因轉(zhuǎn)錄水平的分析及葡萄酒發(fā)酵試驗表明，菌株CD1，2與出發(fā)菌株相比，CAR1基因表達量降低了63％，DUR1，2基因的表達量提高了3.64倍，尿素的含量降低了40.35％，EC的含量降低了34.44％，并且常規(guī)指標無明顯變化。
　　(4)構(gòu)建了敲除CAR1基因同時過表達DUR3基因的突變株CD3。對DUR3基因轉(zhuǎn)錄水平的分析及葡萄酒發(fā)酵試