植物乳桿菌素JLA--9的鑒定及其對芽孢桿菌抑菌機制的研究.pdf

1、乳酸菌細菌素是一類由乳酸細菌核糖體合成且具有抑菌活性的小分子多肽。目前研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌可以產(chǎn)多種細菌素，乳酸菌細菌素由于其具有天然、安全、無毒等特點，目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于世界多個國家的食品防腐和保鮮領(lǐng)域。芽孢桿菌是乳制品、罐裝食品、水果蔬菜等食品中常見的一類能夠引起食品腐敗和食源性疾病的細菌。因此，預(yù)防和控制食品中芽孢桿菌的污染是目前食品安全領(lǐng)域研究的一個熱點。雖然現(xiàn)在已經(jīng)有許多乳酸菌細菌素被報道，但是還沒有廣譜抑制芽孢桿菌的細菌素被研究

2、。目前，人們已經(jīng)逐漸意識到食品中的化學(xué)防腐劑對人體健康造成的潛在危害，因此開發(fā)天然、高效、安全的細菌素在食品保鮮領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用潛力。
　　本論文主要從來源于吉林省的農(nóng)家酸菜中分離純化產(chǎn)廣譜抑制芽孢桿菌細菌素的乳酸菌，對所產(chǎn)細菌素進行分離純化鑒定并對細菌素的生物學(xué)性質(zhì)進行研究，探索細菌素對蠟樣芽孢桿菌芽孢的抑制機理以及通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究手段從分子水平上研究細菌素對蠟樣芽孢桿菌的抑菌機理，為新型生物防腐劑的開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。主要研究

3、結(jié)果分述如下:
　　1.從發(fā)酵酸菜中分離鑒定產(chǎn)廣譜抑制芽孢桿菌細菌素的乳酸菌
　　從吉林省發(fā)酵酸菜食品中分離純化共獲得產(chǎn)酸的革蘭氏陽性菌株580株。以蠟樣芽孢桿菌和短小芽孢桿菌作為指示菌經(jīng)過初篩獲得49株抑菌活性較好的菌株。以枯草芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪地芽孢桿菌、多粘類芽孢桿菌、生孢梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和艱難梭菌作為指示菌進行復(fù)篩，獲得5株抑菌活性較好的菌株。其中編號為JLA-9的菌株在5株菌中具有最好

4、的抑菌活性。對其進行生理生化鑒定，并將其16SrDNA在NCBI網(wǎng)站中進行同源性比較，采用MEGA5.05軟件繪制進化樹。根據(jù)細菌系統(tǒng)發(fā)育分類學(xué)的分析結(jié)果，確定菌株JLA-9為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)。
　　2.細菌素plantaricin JLA-9的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及性質(zhì)研究
　　Lactobacillus plantarum JLA-9在48h的發(fā)酵過程中不斷產(chǎn)酸，到達穩(wěn)定期后產(chǎn)酸

5、基本保持不變。在對數(shù)前期開始產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)，穩(wěn)定期后期產(chǎn)量達到最高。發(fā)酵30h左右菌體進入衰亡期，抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)量保持不變。通過有機溶劑正丁醇萃取、Sephadex LH-20和Sephadex G-25凝膠層析及RP-HPLC純化得到活性單峰，該活性峰對蠟樣芽孢桿菌具有較好的抑菌作用。MALDI-TOF-MS及N-端測序確定抑菌活性物質(zhì)的分子量為1044 Da，其一級結(jié)構(gòu)為Phe-Trp-Gln-Lys-Met-S er-Phe-Al

6、a，經(jīng)BLAST比對確定其為一種新型細菌素將其命名為plantaricin JLA-9。該細菌素對食品中常見的腐敗性及致病性芽孢桿菌具有較廣譜的抑制作用，并具有良好的熱穩(wěn)定性及pH穩(wěn)定性，對常見的蛋白酶敏感。
　　3.Lacotobacillus plantarum JLA-9產(chǎn)細菌素MRS培養(yǎng)基的優(yōu)化
　　采用單因素試驗篩選出植物乳桿菌JLA-9產(chǎn)細菌素MRS培養(yǎng)基的最佳碳源為果糖，添加量為30 g/L;最佳氮源為魚粉蛋白

7、胨、牛肉膏和酵母膏的配比，添加量為15∶15∶7.5 g/L;最佳磷酸鹽緩沖液為磷酸二氫鉀，添加量為3g/L。通過響應(yīng)面分析試驗對植物乳桿菌JLA-9發(fā)酵產(chǎn)細菌素MRS培養(yǎng)基進行優(yōu)化，確定最佳的培養(yǎng)基配方為果糖含量為35.03 g/L、魚粉蛋白胨，牛肉膏和酵母膏的配比為14.5∶14.5∶7.3g/L、磷酸二氫鉀為2.95 g/L，抑菌相對效價較未優(yōu)化前提高2.3倍。
　　4.細菌素plantaricin JLA-9抑制蠟樣芽孢桿

8、菌芽孢機理研究
　　采用2倍稀釋法確定了細菌素plantaricin JLA-9對蠟樣芽孢桿菌的MIC和OIC分別為16μg/mL和32μg/mL。通過研究蠟樣芽孢桿菌芽孢萌發(fā)時折光率、熱穩(wěn)定性及2，6-吡啶二羧酸(DPA)釋放的變化，發(fā)現(xiàn)處理組與對照組芽孢的折光率和熱穩(wěn)定性都顯著降低，芽孢中的DPA釋放到外界環(huán)境中，表明plantaricin JLA-9不能夠抑制芽孢萌發(fā)的開始。通過芽孢萌發(fā)試驗證明萌發(fā)開始是plantarici

9、n JLA-9作用于芽孢的必須條件，plantaricin JLA-9能夠抑制萌發(fā)的芽孢生長成營養(yǎng)菌體細胞。采用MTT法研究了plantaricin JLA-9抑制蠟樣芽孢桿菌芽孢生長的氧化代謝活性，結(jié)果表明添加1×OIC和2×OIC（32μg/mL和64μg/mL）濃度的plantaricin JLA-9處理樣品未檢測到甲瓚的生成，因此證明plantaricin JLA-9能夠抑制芽孢萌發(fā)生長過程的氧化代謝活性。應(yīng)用流式細胞儀研究pl

10、antaricin JLA-9對蠟樣芽孢桿菌芽孢萌發(fā)生長膜完整性的影響，結(jié)果表明添加1×OIC和2×OIC（32μg/mL和64μg/mL）濃度plantaricin JLA-9處理的樣品，與對照相比其PI熒光強度明顯增加，說明plantaricin JLA-9能夠破壞芽孢膜的完整性。以DiOC2為熒光染料，利用多功能酶標(biāo)儀測定plantaricin JLA-9處理后蠟樣芽孢桿菌芽孢的熒光強度，研究plantaricin JLA-9對蠟

11、樣芽孢桿菌芽孢萌發(fā)生長細胞膜電位的影響。結(jié)果表明添加1×OIC和2×OIC（32μg/mL和64μg/mL）濃度plantaricin JLA-9處理的樣品膜電位顯著降低，說明plantaricin JLA-9在芽孢萌發(fā)后導(dǎo)致細胞膜電位降低，最終抑制芽孢生長成營養(yǎng)菌體。
　　5.基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)的plantaricin JLA-9對蠟樣芽孢桿菌的作用機制
　　Plantaricin JLA-9對蠟樣芽孢桿菌碳代謝及氮代謝產(chǎn)生了影

12、響，經(jīng)1/2×MIC(8μg/mL)濃度的plantaricin JLA-9處理后，蠟樣芽孢桿菌糖酵解途徑的fbp、fbaA和gapB基因，三羧酸途徑中sucC、sdhC和mdh基因，脂肪酸-β-氧化途徑的mmgC和atoB基因，氨基酸α-酮戊二酸代謝途徑中的proC、rocF和glsA基因，均明顯上調(diào)。說明經(jīng)過細菌素plantaricin JLA-9處理后，蠟樣芽孢桿菌的葡萄糖無氧分解代謝減少，三羧酸循環(huán)代謝增強，脂肪酸氧化產(chǎn)生的乙酰

13、-CoA可以經(jīng)過三羧酸循環(huán)途徑為生物體產(chǎn)生能量，氨基酸代謝與三羧酸循環(huán)被聯(lián)系起來促進能量的代謝合成。
　　經(jīng)細菌素plantaricin JLA-9處理后，蠟樣芽孢桿菌芽孢形成相關(guān)的重要調(diào)控基因sigE、sigF、sigK和sigG的表達下調(diào)，以及芽孢形成不同階段的芽孢形成基因racA和cotE等也明顯的下調(diào)，因此細菌素plantaricin JLA-9能夠抑制蠟樣芽孢桿菌芽孢的形成。細胞膜相關(guān)基因fabG和fabZ上調(diào)，說明蠟樣

14、芽孢桿增加支鏈脂肪酸的合成從而提高細胞膜的流動性，促進生物膜修復(fù)。
　　細菌素plantaricin JLA-9對蠟樣芽孢桿菌離子轉(zhuǎn)運產(chǎn)生影響。研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)細菌素處理后，kcH基因與nhaC基因上調(diào)。kcH基因與鉀離子的攝入有關(guān)，細胞通過上調(diào)該基因來攝入更多的鉀離子，以維持細胞的滲透壓來保持細胞膜的穩(wěn)定狀態(tài)。nhaC基因發(fā)生上調(diào)，該基因參與芽孢桿菌pH內(nèi)平衡的調(diào)節(jié)，它的上調(diào)說明，由于細胞膜被破壞，鉀離子流失，為了維持細胞的滲透壓需要