隱性孔雀石綠多克隆抗體的制備及電化學阻抗免疫傳感器的組裝.pdf

1、隱性孔雀石綠是三苯甲烷類化學物孔雀石綠在生物體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物和存在形式，殘留時間長，由于其潛在的高毒、高殘留、“三致”等毒副作用，很多國家，包括我國已經(jīng)嚴格限制其使用，但是違規(guī)添加事件屢有發(fā)生，給人類健康帶來嚴重威脅。因此，極有必要建立隱性孔雀石綠及孔雀石綠的快速準確的檢測方法，得到科學即時的結(jié)果，這樣才能實現(xiàn)有效監(jiān)督，保障和促進我國水產(chǎn)品行業(yè)的發(fā)展。本文研究的具體內(nèi)容如下：
　　根據(jù)化學合成原則和半抗原設(shè)計要求，采用以原料為基

2、礎(chǔ)，從源頭進行合成的方法，合成了四種含不同基團和長度連接臂的半抗原，并且提出了一種新的隱性孔雀石綠半抗原的合成路徑，以純碳鏈作為連接臂，并可以通過更換反應(yīng)物實現(xiàn)連接臂的延長。對設(shè)計合成的目標產(chǎn)物分別進行薄層色譜法、質(zhì)譜掃描和核磁氫譜鑒定，證實已成功制備隱性孔雀石綠半抗原，且純度均在95％以上。
　　將設(shè)計合成的半抗原分別通過碳二亞胺法與BSA和OVA偶聯(lián)，并且經(jīng)過紫外光譜和MALDI-TOF-MS對完全抗原進行鑒定和偶聯(lián)比的計算，

3、結(jié)果表明完全抗原制備成功，且免疫原的偶聯(lián)比介于10:1～20:1之間。選用適齡兔進行多克隆抗體的免疫制備，用 ELISA方法檢測得到的抗血清的效價和靈敏度，確定反應(yīng)終點。選用效果最好的抗血清，進行ELISA工作條件的優(yōu)化，建立隱性孔雀石綠酶聯(lián)免疫吸附分析方法。結(jié)果表明，建立的隱性孔雀石綠ELISA檢測方法的靈敏度為2.21 ng/mL，線性范圍為0.15～31.7 ng/mL，最低檢測限為0.06 ng/mL，并用于魚肉樣品的實際檢測中

4、，回收率為79.8～92.4%。
　　選用優(yōu)化得到的抗體進行電化學阻抗免疫傳感器的組裝，并用電化學阻抗譜進行定性和定量分析。通過對苯二胺重氮化修飾玻碳電極，將蛋白還原的納米金簇共價連接到電極表面，并用EDC/NHS作為活化劑，將隱性孔雀石綠多克隆抗體以共價連接的方式固定到了修飾過的玻碳電極表面，BSA封閉，以減少非特異吸附對檢測結(jié)果的影響。根據(jù)抗體抗原特異性反應(yīng)前后電極表面電阻值的變化對隱性孔雀石綠進行了檢測，檢測限為0.03 n