孔雀石綠多克隆抗體的制備及其快速檢測方法的研究.pdf

1、孔雀石綠是一種合成的有毒三苯基甲烷類化合物，因具有預(yù)防和治療水產(chǎn)動物真菌性疾病的作用，且價格低廉操作方被便，廣泛使用在水產(chǎn)養(yǎng)殖，臨床試驗研究表明孔雀石綠對動物器官具有高毒性、高殘留、致畸、致癌、致突變的副作用，因此研究一種能夠快速檢測孔雀石綠的ELISA方法，對水產(chǎn)品的安全檢查具有一定的實際意義。
　　本研究在分析孔雀石綠分子結(jié)構(gòu)和免疫原性的基礎(chǔ)上，合成羧基化孔雀石綠半抗原，半抗原與載體蛋白偶聯(lián)合成孔雀石綠人工抗原，用人工抗原免疫

2、兔子獲得孔雀石綠多克隆抗體，將孔雀石綠多克隆抗體進行純化后用于間接ELISA并對其條件進行優(yōu)化，從而建立間接ELISA快速檢測孔雀石綠的方法，主要研究結(jié)果如下：
　　1.通過化學(xué)方法，由原料4-甲酰基苯甲酸和N,N-二甲基苯胺合成羧基化隱色孔雀石綠（CLMG），再將其氧化生成羧基化孔雀石綠（CMG），分別采用活性酯法和碳二亞胺法偶聯(lián)羧基化孔雀石綠（CMG）獲得人工免疫原（CMG-BSA）和人工包被原（CMG-OVA），利用紫外分光

3、光度法測得半抗原與載體蛋白偶聯(lián)比分別為13.8：1(CMG-BSA)和17.1：1(CMG-OVA)。
　　2.用免疫原(CMG-BSA)免疫動物，第4次免疫后用間接ELISA法初步測定兔子抗血清效價為1：3500，抗血清IC50值為40.44ng/mL。
　　3.通過辛酸-硫酸銨法對免疫血清進行純化處理，經(jīng)SDS-PAGE，表明純化后的多克隆抗體純度較高，通過紫外分光光度法測定純化后的多克隆抗體濃度為11.02mg/mL。

4、通過方陣滴定法確定包被原和純化抗體的最佳稀釋倍數(shù)分別為1：1000，1：8000。
　　4.在此基礎(chǔ)上對包被溶液的選擇、包被條件、封閉溶液的選擇、封閉條件、競爭時間、MG標準溶液與多克隆抗體體積比及抗體稀釋液進行優(yōu)化，經(jīng)過條件優(yōu)化后重新建立MG標準曲線，獲得標準曲線方程y=-42.44x+71.08，R2=0.985。經(jīng)計算MG的半數(shù)抑制率IC50為:3.2ng/mL，檢測限（IC90）可達0.35ng/mL。孔雀石綠與結(jié)構(gòu)類似物