性傳播疾病病原體檢測基因芯片研究.pdf

1、該課題將基因芯片技術(shù)用于性傳播疾病病原體診斷與檢測研究,制備了以熒光標(biāo)記多重不對稱PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的性傳播疾病病原體寡核苷酸檢測芯片,實現(xiàn)了淋球菌、沙眼衣原體和解脲脲原體三種病原體的同時多樣本檢測.通過芯片制備工藝條件研究確定制備性傳播疾病病原體檢測芯片的最佳方案是采用長度40mer,3'端雙功能修飾的寡核苷酸探針點制到醛基片上制備芯片.在此基礎(chǔ)上,設(shè)計并合成了三種病原體以及熒光素酶基因和大豆基因特異的引物和探針序列.以此引物和探針對性

2、病檢測芯片優(yōu)化結(jié)果顯示:選取點樣液A和雜交液B,探針序列靠近熒光標(biāo)記引物端,探針濃度以50μM,雜交溫度以42℃,雜交時間以60min,PCR產(chǎn)物經(jīng)加熱變性后與雜交液以1:2比例制備檢測芯片為宜.對該芯片的檢測靈敏度進行條件優(yōu)化表明:在25μl PCR反應(yīng)體系中,淋球菌、沙眼衣原體和解脲脲原體和熒光素酶基因正向引物濃度分別為0.225μM、0.135μM、0.15μM和0.3μM,反向Cy3標(biāo)記的熒光標(biāo)記引物濃度分別為2.25μM、1.

3、35μM、1.5μM和3μM,dNTP為300 μM,MgCl<,2> 3mM,KCl 75mM,1×PCR緩沖液和2U Taq酶.PCR擴增條件為:預(yù)變性(5 min/94℃);35個循環(huán):變性(30 sec/94℃),退火(30sec/57℃),延伸(30 sec/72℃);延伸:(5 min/72℃).以此條件進行多重PCR擴增,芯片檢測的靈敏度最高,四個基因皆為5×103copies.特異性實驗表明芯片對待檢病原體特異.對60份