海水養(yǎng)殖動物部分病原檢測基因芯片的初步設計.pdf

1、病害嚴重威脅海水養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，如何尋求一種有效的途徑來緩解病害給養(yǎng)殖業(yè)帶來的危害與損失，一直是人們所關注的問題?，F(xiàn)有的病原檢測技術局限性大、效率低、系統(tǒng)性差，急需一種海水養(yǎng)殖動物疾病高通量檢測手段進行策略上的改進，打破技術瓶頸。隨著水產動物病原基礎信息數(shù)據(jù)的日漸豐富，水產動物疾病診斷技術的發(fā)展趨勢不可避免地向著高通量技術方向跨越。 本論文根據(jù)Lightner藍皮書、國際獸疫局(OIE)水生動物疾病名錄、亞太水產養(yǎng)殖中心網(wǎng)絡

2、(NACA)水生動物疾病名錄等，選擇海水養(yǎng)殖鰈形目魚類、鱸形目魚類、對蝦類和雙殼貝類等宿主的主要病毒、真菌、原生動物等幾十種病原微生物作為研究對象，包括14類魚病毒、14類對蝦病毒、魚立克次氏體、3類真菌以及8類原生動物。針對這些研究對象，在Genbank中共檢索收集了27969條相關基因序列，包括海水養(yǎng)殖動物的病原序列26861條，質控系統(tǒng)所需序列1108條。 把在Genbank中分別檢索到病原微生物的核酸序列，進行BLAST

3、搜索比對，Omiga軟件Alignment多重比對，找出各種病原核酸序列的保守區(qū)和特異區(qū)序列，將篩選確定的各條序列按照宿主的不同，分3類同時導入到微陣列專業(yè)的引物和探針設計軟件AlleleID6.0中，根據(jù)引物和探針設計原則，在同一個任務下批量設計出退火溫度等各項參數(shù)十分相似，擴增片段長度為200～500bp的引物。再根據(jù)擴增片段序列，設計長度為57bp的寡核苷酸探針。將設計好的探針再全部導入Omiga軟件進行比對，確定探針之間最多不超

4、過四個連續(xù)堿基相同，而且位置處于引物擴增區(qū)，與引物沒有結合位點，然后交由上海生工合成。 本研究中針對選擇的研究對象，共設計了檢測魚類病原包括備選引物和探針在內的31對引物和31條相對應的寡核苷酸探針，檢測對蝦類病原的37對引物和37條相對應的寡核苷酸探針，檢測雙殼貝類病原的8對引物和8條相對應的寡核苷酸探針。另外還有以宿主序列為模板設計的引物和探針；用來組成質控體系中全程監(jiān)控的陽性內對照，以及由非同源性宿主序列為模板設計的引物和

5、探針，用來組成質控體系中的陽性外對照。 根據(jù)引物和探針的設計結果，按照病原微生物感染宿主的不同，采用基因芯片的原理，將設計合成后的探針按照預先設計的點陣分布用手動點樣儀在尼龍膜上點樣，經(jīng)紫外交聯(lián)后固定在膜上制備成寡核苷酸膜芯片。病原檢測膜芯片分為魚類病原檢測芯片、對蝦類病原檢測芯片和雙殼貝類病原檢測芯片。 根據(jù)實驗室保存和課題合作單位提供的魚類和對蝦類的陽性病料，本文先針對部分引物進行了特異性驗證實驗。在魚類芯片中，所設

6、計的9對特異性引物，分別以含有EHNV、LCDV、TRBIV、LYCIV、ISKNV、RGNNV、IHNV、VHSV、IPNV和YAV的DNA或cDNA為模板，均能特異性的PCR擴增出與實驗設計相符的產物；在對蝦類芯片中，所設計的8對特異性引物，分別以含有WSSV、IHHNV和TSV的DNA或cDNA為模板，均能特異性的PCR擴增出與實驗設計相符的產物；同時驗證了質控體系中的陽性內對照及陽性外對照引物對。之后，采用同步PCR方法和兩步法

7、RT-PCR方法，用基因特異性引物加入地高辛標記的dUTP擴增并標記各個目標序列，標記后的PCR產物用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢查后測定標記產量，并測定標記濃度為10 ng/μl-40 ng/μl之間。將DIG標記的擴增產物分別與魚類病原檢測膜芯片和對蝦類病原檢測膜芯片進行雜交實驗，雜交結束后的反應信號用NBT-BCIP液顯色后進行分析，驗證了魚類病原檢測膜芯片上11條寡核苷酸探針的雜交特異性，包括3條質控系統(tǒng)的探針和8條分別檢測EHNV、

8、LCDV、TRBIV、LYCIV、ISKNV、RGNNV、IHNV、VHSV、IPNV和YAV的探針；對蝦類病原檢測膜芯片上12條寡核苷酸探針，包括4條質控系統(tǒng)的探針和8條分別檢測WSSV、IHHNV、TSV病原的探針。之后，采用膜芯片檢測人工合成的ISAV和MBV基因以及從河北唐山取樣的發(fā)病對蝦樣品，又成功驗證了魚類病原檢測芯片上ISAV探針和對蝦病原檢測芯片上MBV和HPV探針。 本文最后對基因芯片技術應用于海水養(yǎng)殖動物病原