阿霉素-姜黃素共載藥脂質(zhì)-聚合物納米粒的研制及其治療骨肉瘤的研究.pdf

1、骨肉瘤(Osteosarcoma，OS)是一種常見(jiàn)的惡性骨腫瘤，在兒童和年輕成年人中發(fā)病率最高，其侵襲性強(qiáng)、預(yù)后差，占原發(fā)性骨腫瘤的60％。目前用于OS治療的化療藥物主要有阿霉素、順鉑、甲氨蝶呤、異環(huán)磷酰胺、姜黃素等，但是在腫瘤的治療過(guò)程中，單一藥物化療效果均不理想，藥物毒副作用大，且容易產(chǎn)生多藥耐藥，影響患者預(yù)后。因此，腫瘤化療方案中提倡多種藥物聯(lián)合治療，選擇不同作用機(jī)制、毒副作用不重疊的藥物，起到協(xié)同抗腫瘤作用，以最低有效劑量，達(dá)到

2、高療效、少抗藥性、輕毒副作用的目的。
　　納米粒載藥系統(tǒng)因能夠增加藥物的溶解度，延長(zhǎng)藥物血液循環(huán)的時(shí)間;改善藥物的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)特性，促進(jìn)藥物在細(xì)胞內(nèi)的傳遞，提高藥物對(duì)腫瘤組織的靶向性;實(shí)現(xiàn)藥物在腫瘤部位的被動(dòng)或主動(dòng)靶向以及生理環(huán)境敏感的藥物釋放，顯著降低藥物毒副作用等優(yōu)點(diǎn)近年來(lái)備受關(guān)注，被認(rèn)為是搭載抗癌藥的最適宜劑型。
　　阿霉素(DOX)是一種蒽環(huán)類(lèi)藥物，具有光譜抗腫瘤活性，用于治療骨肉瘤、肝癌、胃癌、淋巴癌等惡性腫

3、瘤。有研究證實(shí)DOX與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用能夠顯著提升腫瘤的治療效果。但DOX具有一定的心臟毒性，影響肝腎功能，并能產(chǎn)生骨髓抑制等毒副作用。
　　姜黃素(CUR)是從中國(guó)傳統(tǒng)中藥姜黃中提取的一種天然活性物質(zhì)，其分子中含有二酮結(jié)構(gòu)，是一種黃色多酚類(lèi)色素。近年來(lái)的研究表明CUR有多種藥理作用，對(duì)骨肉瘤、前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等癌細(xì)胞有促進(jìn)凋亡的作用。CUR為從植物中提取的天然色素，其毒副作用小，對(duì)人體沒(méi)有損傷，可作為一種有潛力的高效低毒

4、抗腫瘤藥物應(yīng)用于臨床。但CUR水溶性低，致使其口服生物利用度低，在體內(nèi)難以達(dá)到有效血藥濃度，限制了其應(yīng)用。另外其半衰期短，在體內(nèi)代謝和清除速率快，也制約了其臨床應(yīng)用。
　　目的:
　　本項(xiàng)研究中，為了克服DOX的多藥耐藥及嚴(yán)重不良反應(yīng)，同時(shí)提高姜黃素的溶解度和生物利用度、延長(zhǎng)其半衰期，將藥物聯(lián)合治療和脂質(zhì)納米粒相結(jié)合，設(shè)計(jì)并制備了阿霉素-姜黃素共載藥脂質(zhì)聚合物納米粒(DOX+CUR LPNs)，通過(guò)體內(nèi)外及荷瘤小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)確

5、定其對(duì)骨肉瘤的治療效果。
　　方法:
　　1、阿霉素-姜黃素共載藥脂質(zhì)聚合物納米粒的制備及表征研究
　　(1) LPNs的制備:利用TEA、DMSO將DOX溶解制備基質(zhì);利用PLGA、二氯甲烷將CUR、DOX溶解制備油相;利用水將DLPC、膽固醇、PEG2k-DSPE溶解制備水相。將油相緩慢加入水相中混合，利用改良溶劑萃取法制備載藥納米粒。
　　(2)利用透射電子顯微鏡(TEM)觀察所制備的納米粒形態(tài);利用光子相

6、關(guān)光譜法(PCS)測(cè)量LPNs粒徑、多分散指數(shù)及Zeta電位。通過(guò)紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定LPNs中藥物包封率(DEE)及載藥量(DLC)，其中測(cè)定DOX的波長(zhǎng)為485 nm，測(cè)定CUR的波長(zhǎng)為430 nm。
　　(3)測(cè)定了LPNs的穩(wěn)定性。將LPNs重懸于生理鹽水中，在4℃條件下攪拌孵育，分別在第1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35天取樣測(cè)定各組納米粒粒徑大小。在血清中的穩(wěn)定性用含10％胎牛血清(FBS)的P

7、BS溶液進(jìn)行，37℃孵育12h，分別在第0、2、4、8、12h取樣，測(cè)定LPNs粒徑大小。
　　(4)LPNs的體外釋藥性采用透析法進(jìn)行。將LPNs混懸液放入透析袋，將透析袋放入50 mL釋放介質(zhì)（含0.1％ Tween-80的PBS緩沖液，pH7.4）中，37℃恒溫水浴震蕩，分別在第0、2、4、6、12、24、48、72、96 h取樣，每次取樣結(jié)束后置換50 mL新的釋放介質(zhì)，通過(guò)紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定溶液中藥物含量。

8、　　2、阿霉素-姜黃素共載藥脂質(zhì)聚合物納米粒抗腫瘤活性研究
　　(1)LPNs的體外抗腫瘤作用評(píng)價(jià)利用MTT法進(jìn)行。將5*103個(gè)KHOS細(xì)胞接種于96孔板37℃培養(yǎng)24 h，加入藥物使每孔中藥物濃度分別為0.5、1.0、5.0、10、50μM，37℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入MTT溶液，3h后加入DMSO顯色，570 nm測(cè)吸光值。根據(jù)吸光值計(jì)算藥物抑制細(xì)胞增殖活性IC50。
　　(2)藥物體內(nèi)組織分布采用5-6周齡BALB/

9、c裸鼠進(jìn)行，每只小鼠皮下注射1*106個(gè)KHOS細(xì)胞，一周后尾靜脈注射藥物。藥物注射后15 min、1h、2h、8h、24 h、48 h、120 h時(shí)，每組分別處死兩只小鼠，剝?nèi)∧[瘤、心、肝、脾、肺、腎，迅速稱(chēng)重并分別用生理鹽水勻漿處理，利用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定不同組織中DOX和CUR藥物含量。
　　(3)LPNs的體內(nèi)抗腫瘤活性利用5-6周齡BALB/c小鼠進(jìn)行，小鼠隨機(jī)分為8組，分別為DOX+CUR LPNs組、DOX L

10、PNs組、CUR LPNs組、LPNs組、DOX+CUR溶液組、DOX溶液組、CUR溶液組、空白對(duì)照組。每組小鼠皮下注射1*106個(gè)KHOS細(xì)胞，一周后開(kāi)始給藥，采用尾靜脈注射給藥，每3天給藥一次，每次給藥前測(cè)定小鼠體重及腫瘤大小，連續(xù)給藥3周。給藥結(jié)束后頸椎脫位法處死小鼠，剝?nèi)∧[瘤，稱(chēng)重并測(cè)量大小，計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)抑制指數(shù)(TGI)。
　　結(jié)果:
　　1、阿霉素-姜黃素共載藥脂質(zhì)聚合物納米粒的制備及表征研究
　　(1)通

11、過(guò)改良溶劑萃取/蒸發(fā)法制備了共載藥DOX+CUR脂質(zhì)聚合物納米粒(DOX+CUR LPNs)、單獨(dú)載藥DOX的脂質(zhì)聚合物納米粒(DOX LPNs)、單獨(dú)載藥CUR的脂質(zhì)聚合物納米粒(CUR LPNs)、及不載藥脂質(zhì)聚合物納米粒(LPNs)。透射電鏡下觀察制備的納米粒呈規(guī)整的球形，粒徑大小在100 nm左右，粒徑大小較均一，PDI為0.17-0.21，分散度適中，Zeta電位絕對(duì)值大于30 mV，分散體系穩(wěn)定。
　　(2)通過(guò)紫外-

12、可見(jiàn)分光光度法測(cè)定DOX的藥物包封率約為85％，CUR的藥物包封率約為80％，且單獨(dú)載藥與DOX+CUR共載藥體系兩種藥物的包封率相差不大。DOX與CUR單獨(dú)載藥的LPNs載藥量分別為13.2、10.6，DOX+CUR共載藥LPNs兩種藥物的載藥量分別為9.1、8.3，略低于單獨(dú)載藥時(shí)的載藥量。
　　(3)初步考察了LPNs的穩(wěn)定性，在生理鹽水中35天納米粒粒徑大小沒(méi)有顯著變化，在血清中12h粒徑大小沒(méi)有顯著變化，說(shuō)明制備的LPN

13、s性能穩(wěn)定。
　　(4)通過(guò)透析法測(cè)定了LPNs的體外釋藥特性，結(jié)果顯示LPNs中藥物DOX和CUR可以在體外持續(xù)緩慢釋放長(zhǎng)達(dá)48 h。
　　2、阿霉素-姜黃素共載藥脂質(zhì)聚合物納米粒抗腫瘤活性研究
　　(1)利用MTT法測(cè)定不同藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性及細(xì)胞存活率。結(jié)果表明相同藥物濃度下，包覆兩種藥物的DOX+CUR LPNs對(duì)腫瘤KHOS細(xì)胞的殺傷作用大于包覆單種藥物的納米粒制劑(P＜0.05)。載藥納米粒制劑對(duì)腫瘤

14、KHOS細(xì)胞的殺傷作用大于藥物溶液(P＜0.05)。納米粒制劑和藥物溶液中隨著藥物濃度的增加，對(duì)KHOS腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性均越大。
　　2)以抑制細(xì)胞增殖活性IC50為參數(shù)，測(cè)定不同藥物制劑的IC50值。DOX+CUR LPNs組抑制細(xì)胞增殖活性的IC50值最低，為0.6μM;包覆兩種藥物的納米粒制劑IC50值優(yōu)于包覆單種藥物的納米粒。同樣，載藥納米粒制劑IC50值優(yōu)于游離藥物溶液。
　　3)測(cè)定了體內(nèi)藥物分布情況。結(jié)果顯示

15、DOX+CUR藥物溶液中DOX和CUR主要分布于心臟和腎臟;而DOX+CUR LPNs中DOX和CUR主要作用于腫瘤部位，藥物在腫瘤組織中的濃度明顯高于其他組織。表明納米粒制劑能有效的提高藥物的靶向性，減少藥物對(duì)人體正常組織器官的損害。
　　4)研究了不同藥物制劑的體內(nèi)抗腫瘤作用。結(jié)果表明最明顯的腫瘤消退發(fā)生在DOX+CUR LPNs一組，腫瘤生長(zhǎng)被顯著延遲，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)該組小鼠腫瘤體積僅為182 mm2，而空白對(duì)照組（注射生理鹽水

16、）小鼠體內(nèi)腫瘤大小為973 mm2。結(jié)果顯示DOX+CUR LPNs治療的骨肉瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)抑制指數(shù)最高，為81.3％，明顯高于其他給藥組。另外空白對(duì)照組小鼠還觀察到食物攝入量減少、精神萎靡不振、活動(dòng)量減少，而在其他給藥組小鼠中都沒(méi)有觀察到這種現(xiàn)象。
　　結(jié)論:
　　阿霉素-姜黃素共載藥脂質(zhì)-聚合物納米粒(DOX+CUR LPNs)具有良好的抗骨肉瘤作用，克服了單種藥物治療帶來(lái)的藥物毒副作用，同時(shí)可以靶向腫瘤部位，增加藥物在