姜黃素對人骨肉瘤細(xì)胞影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：骨肉瘤是最常見的原發(fā)于骨組織的惡性腫瘤，好發(fā)于兒童及青少年，其惡性程度高，易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。治療方法包括手術(shù)治療、化療、放射治療及綜合療法，新輔助化療的應(yīng)用使骨肉瘤的治愈率有了很大的提高，但臨床治療，特別是對于多藥耐藥(multidrug resistance MDR)病例的治療仍存在許多難題。探索新的、有效的化療藥物將有助于骨肉瘤的治療。 姜黃(Curcuma)是一種常用中藥，它廣泛應(yīng)用于食品上色和佐味劑。從姜

2、黃中提取的酚性色素--姜黃素(Curcumin，Cur)是姜黃的主要有效成份，姜黃具有多方面的藥理作用，如抗炎、抗氧化、抗凝、降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化及抗腫瘤等作用，尤其是作為一種具有良好發(fā)展前景的抗癌藥物，其抗腫瘤作用已日益引起人們的重視，成為近年來研究的熱點(diǎn)。姜黃素的抗癌機(jī)理是多方面的，其中誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制受到人們的廣泛關(guān)注。有研究表明，姜黃素能抑制多種體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞如前列腺癌、鼻咽癌、胃癌、結(jié)腸癌、肝癌等的生長及增殖，并誘

3、導(dǎo)其凋亡，且可逆轉(zhuǎn)或部分逆轉(zhuǎn)這些腫瘤細(xì)胞的P-糖蛋白(P-gp)介導(dǎo)的多藥耐藥?；熢趷盒阅[瘤的治療中具有非常重要的作用，而耐藥性是化療失敗的最常見和最難以克服的問題之一。70年代中期，Juliano等人發(fā)現(xiàn)了腫瘤的多藥耐藥(MDR)現(xiàn)象，即對一種藥物耐藥的腫瘤，同時(shí)對另外一些與之化學(xué)結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制完全不同的藥物也有交叉耐藥現(xiàn)象。因此，揭示腫瘤產(chǎn)生多藥耐藥性的機(jī)理及其與臨床化療之間的關(guān)系成為人們研究的熱點(diǎn)。但姜黃素對人骨肉瘤細(xì)胞上述方面

4、作用的研究尚未見報(bào)道。 本研究采用MTT比色法檢測入骨肉瘤細(xì)胞U-20S的增殖；Hoechst 33258染色后熒光顯微鏡法觀察U-20S細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變，Annexin V-FITC/PI雙染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡：Caspase活性定量檢測試劑盒檢測半胱天冬特異性蛋白酶-9，8，3(Caspase-9，8，3)的活性，探討姜黃素對體外培養(yǎng)的人骨肉瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響與可能機(jī)制，并進(jìn)一步探討姜黃素對人骨肉瘤U-20S

5、耐藥細(xì)胞U-20S/ADM中多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)作用。為臨床上骨肉瘤的治療提供新的理論與方法。 　　第一部分姜黃素對人骨肉瘤U-20S細(xì)胞的作用研究目的：觀察姜黃素對人骨肉瘤U-20S細(xì)胞增殖、凋亡的影響，探討姜黃素對人骨肉瘤的作用。 方法：四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法檢測U-20S細(xì)胞的增殖；Hoechst 33258染色后熒光顯微鏡法觀察U-20S細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變，并計(jì)算凋亡核百分率；Annexin V-FITC/P

6、I雙染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡；Caspase活性定量檢測試劑盒檢測半胱天冬特異性蛋白酶－9，8，3(Caspase－9，8，3)的活性。 結(jié)果： 1.姜黃素可顯著抑制U-20S細(xì)胞的體外增殖，并呈濃度和時(shí)間依賴性。 2.Hoechst 33258染色顯示U-20S細(xì)胞經(jīng)姜黃素(20μmol/L)分別處理24h和48h后，細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，形態(tài)學(xué)變化表現(xiàn)為凋亡細(xì)胞體積縮小，核固縮，鏡下細(xì)胞核呈致密濃染或碎塊狀致密濃

7、染。FACS檢測結(jié)果顯示，20μmol/L姜黃素處理12h、24h、48h后的凋亡細(xì)胞數(shù)分別為13.81±1.07％、27.03±2.32％、40.76±3.96％。U-20S細(xì)胞分別經(jīng)10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L姜黃素處理48h后，凋亡細(xì)胞數(shù)逐漸增多，凋亡核百分率計(jì)數(shù)分別為(11.26±3.03)％，(32.15±2.88)％，(55.24+4.40)％。FACS檢測結(jié)果顯示，10μmol/L、20μmol/L

8、、40μmol/L姜黃素處理U-20S細(xì)胞48h后的凋亡細(xì)胞數(shù)分別為16.26±1.44％、34.45±2.55％、60.4±4.01％。U-20S細(xì)胞經(jīng)姜黃素(20μmol/L、40μmol/L)處理12h后，Caspase-9，8，3的活性顯著增加。 結(jié)論： 1.姜黃素能明顯抑制人骨肉瘤U-20S細(xì)胞的體外增殖。 2.姜黃素可誘導(dǎo)人骨肉瘤U-20S細(xì)胞發(fā)生凋亡。 3.姜黃素誘導(dǎo)人骨肉瘤U-20S凋亡可

9、能與Caspase-9，8，3的活性增加有關(guān)。 4.姜黃素為臨床上骨肉瘤的治療提供了一種新方法。 第二部分姜黃素對人骨肉瘤多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)作用研究目的：觀察姜黃素(Cur)對多藥耐受糖蛋白(P-gp)介導(dǎo)的人骨肉瘤U-20S/ADM細(xì)胞多藥耐藥(MDR)的逆轉(zhuǎn)作用。 方法：MTT法觀察MDR的逆轉(zhuǎn)；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)羅丹明-123積聚和外排的影響；RT-PCR方法檢測細(xì)胞內(nèi)MDR1基因變化水平；Westen bl

10、ot方法檢測細(xì)胞內(nèi)P-gp的變化水平。 結(jié)果： 1.MTT顯示姜黃素20μmol/L能增加不同濃度阿霉素對U-20S/ADM細(xì)胞的抑制作用(P<0.01)，且姜黃素對阿霉素為2.0μg/ml時(shí)的U-20S/ADM細(xì)胞抑制作用增加幅度達(dá)49％。 2.FCM結(jié)果顯示，姜黃素能增加阿霉素對U-20S/ADM的細(xì)胞毒性作用，且呈劑量依賴關(guān)系。 3.RT-PCR檢測顯示，耐藥細(xì)胞株U-20S/ADM中MDR1的表達(dá)

11、較U-20S增加，姜黃素對U-20S/ADM細(xì)胞MDR1的表達(dá)無明顯影響。 4. Western blot結(jié)果顯示，耐藥細(xì)胞株U-20S/ADM中P-gp的表達(dá)較U-20S增加，姜黃素對U-20S/ADM細(xì)胞P-gp的表達(dá)無明顯影響。 結(jié)論： 1.姜黃素可有效逆轉(zhuǎn)U-20S/ADM細(xì)胞的多藥耐藥現(xiàn)象，其機(jī)制并非阻止MDR1基因的擴(kuò)增及降低P-gp的表達(dá)，而可能是抑制耐藥細(xì)胞膜上P-gp的功能。 2.MDR