長(zhǎng)鏈非編碼RNA ODRUL調(diào)控骨肉瘤阿霉素耐藥的機(jī)制研究.pdf

1、背景：骨肉瘤是兒童和青少年中最常見(jiàn)的原發(fā)性惡性骨腫瘤，化療是其最重要的輔助療法，然而阿霉素耐藥的出現(xiàn)極大地阻礙了其治療。長(zhǎng)鏈非編碼RNA在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用的報(bào)道已有很多。尋找與骨肉瘤阿霉素耐藥相關(guān)的lncRNA可能有助于提高臨床的化療敏感性。
　　目的：為了從lncRNA的角度探索骨肉瘤阿霉素耐藥的潛在機(jī)制并且深入討論化療耐藥發(fā)生的原因及可能的克服骨肉瘤阿霉素耐藥的潛在策略。
　　方法：采用第三代人類lncR

2、NA-mRNA復(fù)合芯片在三組配對(duì)的阿霉素抵抗和敏感的骨肉瘤細(xì)胞(MG63/DXR和MG63)中篩選差異表達(dá)的lncRNA和mRNA，隨機(jī)選擇15個(gè)差異表達(dá)的lncRNA（5類）通過(guò)qRT-PCR法在細(xì)胞系中檢測(cè)其芯片結(jié)果的一致性；通過(guò)qRT-PCR法在配對(duì)的MG63/DXR和MG63細(xì)胞及另一對(duì)配對(duì)的阿霉素抵抗和敏感的骨肉瘤細(xì)胞（KH-OS/DXR和KH-OS）、其它阿霉素敏感的骨肉瘤細(xì)胞（U-2 OS和Saos2）中檢測(cè)差異表達(dá)倍數(shù)最

3、大的3個(gè)lncRNA（2個(gè)上調(diào)倍數(shù)最大、1個(gè)下調(diào)倍數(shù)最大）的表達(dá)量；然后我們命名表達(dá)上調(diào)倍數(shù)最大的lncRNA-lncRNA ENST00000563280為骨肉瘤阿霉素耐藥相關(guān)上調(diào)lncRNA，即lncRNA ODRUL，并在配對(duì)的60例骨肉瘤病人腫瘤組織中通過(guò)qRT-PCR的方法檢測(cè)lncRNA ODRUL的表達(dá)量并與臨床參數(shù)相結(jié)合探索其可能的臨床意義； CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，通過(guò)siRNA下調(diào)阿霉素抵抗的骨肉瘤細(xì)胞（MG63/DXR

4、和KH-OS/DXR）中l(wèi)ncRNA ODRUL的表達(dá)后，骨肉瘤細(xì)胞對(duì)于阿霉素敏感性的變化；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡的改變；Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)細(xì)胞侵襲和細(xì)胞遷移能力的改變；為進(jìn)一步探討lncRNA調(diào)控骨肉瘤阿霉素耐藥的分子機(jī)制，行生物信息學(xué)分析lncRNA ODRUL與ABCB1、EGFR、ABCC3、IL-6等耐藥相關(guān)基因的表達(dá)的相關(guān)性；通過(guò)siRNA下調(diào)阿霉素抵抗的骨肉瘤細(xì)胞（MG63/DXR和KH-OS/

5、DXR）中l(wèi)ncRNA ODRUL的表達(dá)后，通過(guò)PCR和WB實(shí)驗(yàn)分別在RNA和蛋白質(zhì)水平檢測(cè)這些基因的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：通過(guò)全基因組的lncRNA-mRNA表達(dá)譜分析，我們發(fā)現(xiàn)3465個(gè)lncRNA（其中1761個(gè)上調(diào)且1704個(gè)下調(diào)）和3278個(gè)mRNA（其中1607個(gè)上調(diào)且1671個(gè)下調(diào)）在三組配對(duì)的阿霉素抵抗的骨肉瘤細(xì)胞MG63/DXR和配對(duì)的阿霉素敏感的骨肉瘤細(xì)胞MG63中差異表達(dá)（差異倍數(shù)＞2，P<0.05且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)

6、率（FDR）<0.05）；PCR驗(yàn)證隨機(jī)選擇的15個(gè)lncRNA的表達(dá)差異與芯片結(jié)果全部一致，這說(shuō)明了芯片平臺(tái)的可靠性；同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)lncRNA ODRUL在阿霉素敏感和抵抗的骨肉瘤細(xì)胞系中表達(dá)趨勢(shì)始終是一致的，即耐藥株中表達(dá)量明顯高于敏感株，在一定程度上說(shuō)明了其穩(wěn)定性和廣泛性；除此之外，骨肉瘤化療抵抗組腫瘤組織中l(wèi)ncRNA ODRUL的表達(dá)明顯高于化療敏感組，且早期肺轉(zhuǎn)移組表達(dá)明顯高于非早期肺轉(zhuǎn)移組，同時(shí)高表達(dá)lncRNA ODRU

7、L的骨肉瘤病人的生存率和生存時(shí)間明顯低于低表達(dá)組；在MG63/DXR和KH-OS/DXR細(xì)胞中，通過(guò)siRNA下調(diào)lncRNA ODRUL的表達(dá)后，細(xì)胞對(duì)于阿霉素的敏感性均較對(duì)照組增強(qiáng)，G1期細(xì)胞比例增加，晚期凋亡細(xì)胞比例增加，同時(shí)細(xì)胞侵襲和遷移能力較對(duì)照組減弱；另外生物信息學(xué)分析（共表達(dá)分析）發(fā)現(xiàn)lncRNA ODRUL與ABCB1、EGFR、ABCC3、IL-6等耐藥相關(guān)基因的表達(dá)的相關(guān)性均較高，相關(guān)系數(shù)在0.995以上或者-0.9

8、95以下；在MG63/DXR和KH-OS/DXR細(xì)胞中，通過(guò)siRNA下調(diào)lncRNA ODRUL的表達(dá)后，PCR和WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示只有ABCB1的表達(dá)明顯下調(diào)，其余基因的表達(dá)無(wú)明顯變化，這提示lncRNA ODRUL可能是通過(guò)影響經(jīng)典耐藥相關(guān)基因ABCB1的表達(dá)來(lái)調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞的化療抵抗性的。
　　結(jié)論：在本次研究中，我們?cè)谂鋵?duì)的阿霉素抵抗的骨肉瘤細(xì)胞MG63/DXR和配對(duì)的阿霉素敏感的骨肉瘤細(xì)胞MG63中發(fā)現(xiàn)了眾多差異表達(dá)的l