hMLH1基因甲基化與骨肉瘤阿霉素耐藥的關(guān)系及其臨床意義.pdf

1、第一章hMLH1基因的甲基化在骨肉瘤細(xì)胞株阿霉素耐藥中的作用研究
　　目的：探討hMLH1基因的啟動(dòng)子甲基化與骨肉瘤耐阿霉素細(xì)胞株MG63/ADR的阿霉素耐藥是否相關(guān);探討去甲基化藥物5-氮-2'-脫氧胞苷對MG63/ADR細(xì)胞的hMLH1基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)、hMLH1基因的表達(dá)以及阿霉素耐受性的是否有影響。
　　方法：甲基化特異性PCR法對骨肉瘤阿霉素耐藥細(xì)胞株MG63/ADR及其親本株MG63細(xì)胞的hMLH1基因啟動(dòng)

2、子的甲基化狀態(tài)的檢測;MTT法及流式細(xì)胞術(shù)檢測MG63/ADR細(xì)胞對阿霉素的耐藥指數(shù)、5-氮-2'-脫氧胞苷對MG63/ADR細(xì)胞的毒性作用以及MG63/ADR細(xì)胞經(jīng)不同濃度的5-氮-2'-脫氧胞苷干預(yù)48h后其對阿霉素的半數(shù)抑制濃度及耐藥逆轉(zhuǎn)指數(shù);甲基化特異性PCR法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法及Western blot法測定5-氮-2'-脫氧胞苷對MG63/ADR細(xì)胞hMLH1基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)、mRNA及蛋白的表達(dá)影響。
　　

3、結(jié)果：MG63細(xì)胞的hMLH1基因的啟動(dòng)子為非甲基化;MG63/ADR細(xì)胞的hMLH1基因的啟動(dòng)子為部分甲基化;MG63和MG63/ADR細(xì)胞對阿霉素的半數(shù)抑制濃度分別為2.28±0.12μM和11.18±0.11μM，MG63/ADR的耐藥指數(shù)為4.90，確定為骨肉瘤的阿霉素耐藥株;5-氮-2'-脫氧胞苷干預(yù)48h，50μM5-氮-2'-脫氧胞苷為MG63/ADR細(xì)胞的無毒劑量，100μM5-氮-2'-脫氧胞苷為其低毒劑量;MG63/

4、ADR細(xì)胞被無毒劑量及低毒劑量5-氮-2'-脫氧胞苷處理后，阿霉素對MG63/ADR細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度分別降至6.18±0.13μM和4.42±0.12μM;耐藥逆轉(zhuǎn)指數(shù)分別為1.81、2.53;無毒劑量和低毒劑量5-氮-2'-脫氧胞苷都能相當(dāng)好地去除hMLH1基因啟動(dòng)子的甲基化，hMLH1 mRNA及其蛋白的表達(dá)增高。
　　結(jié)論：骨肉瘤MG63/ADR細(xì)胞為hMLH1基因啟動(dòng)子部分甲基化的細(xì)胞株，MG63為hMLH1基因啟動(dòng)子非

5、甲基化的細(xì)胞株。hMLH1基因啟動(dòng)子的甲基化可能參與了骨肉瘤MG63/ADR細(xì)胞的阿霉素耐藥。無毒劑量和低毒劑量5-氮-2-脫氧胞苷能相當(dāng)好的去除hMLH1基因啟動(dòng)子的甲基化且對細(xì)胞無增殖抑制，使hMLH1基因的mRNA和蛋白的表達(dá)上調(diào)，從而部分逆轉(zhuǎn)骨肉瘤MG63/ADR細(xì)胞對阿霉素的耐藥。圖13幅，表8個(gè)，參考文獻(xiàn)41篇。
　　第二章骨肉瘤組織中hMLH1基因甲基化狀態(tài)及其蛋白表達(dá)與骨肉瘤臨床病理及預(yù)后的關(guān)系
　　目的：檢

6、測新診斷的骨肉瘤組織中hMLH1基因的甲基化狀態(tài)，探討骨肉瘤組織中hMLH1基因的甲基化與骨肉瘤患者的臨床病理和預(yù)后之間的關(guān)系。
　　方法：酚/氯仿法提取50例骨肉瘤患者的福爾馬林固定石蠟包埋骨肉瘤組織的DNA;巢式甲基化特異性PCR法檢測hMLH1基因的甲基化狀態(tài);x2檢驗(yàn)分析hMLH1基因的甲基化狀態(tài)與患者臨床病理資料的關(guān)系;hMLH1基因的甲基化與患者的總體生存、無瘤生存采用單因素分析Kaplan-Meier法，并對生存曲線

7、進(jìn)行對數(shù)秩和(Log-rank)檢驗(yàn)。hMLH1基因的甲基化與其蛋白表達(dá)的相關(guān)性采用Spearman等級相關(guān)分析。
　　結(jié)果：50例骨肉瘤組織樣本中巢式MSP擴(kuò)增成功的有46例，其中發(fā)生了hMLH1基因甲基化的有20例，占44.48％。hMLH1基因的甲基化與患者不同年齡段、性別、病理類型、Enneking分期、分級等均無關(guān)，只與5年無瘤生存相關(guān)?？傮w生存的單因素分析，hMLH1基因甲基化組與非甲基化組患者的總體生存曲線分離，非甲