一種文蛤多肽基因的克隆、原核表達(dá)、純化及功能性研究.pdf

1、本研究結(jié)合分子生物學(xué)、微生物學(xué)及發(fā)酵工程技術(shù)與理論，構(gòu)建文蛤原肌球蛋白原核表達(dá)工程菌及使用親和層析的方法得到了目的蛋白。
　　方法：根據(jù)基因工程技術(shù)結(jié)合原肌球蛋白相關(guān)基因信息，由其基因的特點設(shè)計出兩段PCR引物，擴(kuò)增基因得到目的基因，測序分析克隆結(jié)果。使用T載體快速擴(kuò)增克隆目的基因，連接目的基因與表達(dá)載體。然后通過大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)得到目的產(chǎn)物，使用親和層析技術(shù)純化目的蛋白。結(jié)果：文蛤原肌球蛋白多肽（MMTM）是一種抗癌多肽，分子大

2、小約為32kDa。從蛋白特性分析結(jié)果中，蛋白理論上pI值為4.5?；驕y序結(jié)果與基因文庫中文蛤原肌球蛋白序列有十幾個堿基差異，而翻譯為蛋白后目的蛋白的結(jié)果和目的基因一致，這種差異的原因可能是原核表達(dá)載體大腸桿菌的密碼子偏好性和真核生物不同。最終由IPTG誘導(dǎo)發(fā)酵表達(dá)目的蛋白，凝膠分析可以看到在32kDa左右有一深色條帶，使用蛋白測序分析這種蛋白即為目的產(chǎn)物。
　　發(fā)酵過程中發(fā)現(xiàn)目的產(chǎn)物的產(chǎn)量沒有達(dá)到預(yù)計要求，為了后續(xù)的藥理學(xué)實驗研

3、究所以設(shè)計了優(yōu)化培養(yǎng)以提高目的蛋白的產(chǎn)量。方法：單因素實驗確定幾個因素最適條件，并篩選培養(yǎng)基的主要因素，選用五種培養(yǎng)基LB、LB+M9、M9、SOB、2*TY的搖瓶發(fā)酵，再根據(jù)結(jié)果設(shè)計培養(yǎng)基優(yōu)化實驗。首先使用PB設(shè)計確定發(fā)酵的主要因素及水平，然后由 PB實驗篩選因素中的最大影響因素設(shè)計交互實驗結(jié)果得到各個因素最佳組合水平。結(jié)果：驗證了適合發(fā)酵培養(yǎng)的因素有：有機(jī)碳源如葡萄糖、酵母粉及胰蛋白胨等，氮源如氯化銨、酵母粉及胰蛋白胨，無機(jī)鹽成分等

4、。這些因素都會影響發(fā)酵的進(jìn)行，但環(huán)境因素如pH及溶氧量等因素也是制約的因素，而由于條件的限制實驗未能進(jìn)行。從五種培養(yǎng)基的篩選得出LB+M9混合培養(yǎng)基是大腸桿菌培養(yǎng)的合適選擇，搖瓶發(fā)酵中菌體量達(dá)到50g/L，說明充足的營養(yǎng)可以提高生物利用。PB設(shè)計結(jié)果說明葡萄糖、酵母粉及硫酸鎂是影響目的蛋白產(chǎn)量的主要因素，然后利用中心點實驗設(shè)計驗證這三種因素的相互作用及結(jié)果，結(jié)果顯示整模型統(tǒng)計學(xué)有效，設(shè)計符合發(fā)酵實驗要求，其中葡萄糖和酵母粉對實驗結(jié)果具有

5、交互影響，通過實驗優(yōu)化驗證目的產(chǎn)物得率提高了56％。
　　通過體外抑制實驗驗證了目的產(chǎn)物對癌細(xì)胞抑制作用。利用MTT方法評價目的蛋白的細(xì)胞活性，DAPI染色方法說明了目的蛋白對癌細(xì)胞核形態(tài)及變化的作用，從而評價藥物的作用。方法：研究通過體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)及MTT細(xì)胞抑制率實驗評價了MMTM蛋白的癌細(xì)胞抑制活性。使用DAPI染色觀察到MMTM細(xì)胞形態(tài)有顯著變化。結(jié)果：細(xì)胞抑制實驗表明 MMTM對細(xì)胞有很好的抑制作用，在高濃度情況下可以