牛乳鐵蛋白N末端多肽基因的克隆、表達(dá)及抗菌活性的研究.pdf

1、乳鐵蛋白N端是生物功能活躍的區(qū)域。乳鐵蛋白肽(LFcin)是乳鐵蛋白在酸性環(huán)境下經(jīng)胃蛋白酶作用N端釋放的一段多肽，廣泛存在于動(dòng)物的乳汁、體液、淚液、唾液、血漿、中性粒細(xì)胞及多種組織中。具有抗菌、抗病毒、抗氧化、消炎、抗癌、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、促進(jìn)骨細(xì)胞生長(zhǎng)等多種生物功能，在眾多的功能中，抗菌功能是最引人注目的，具有很好的應(yīng)用前景。天然牛乳鐵蛋白(bLF)是目前牛乳鐵蛋白肽(bLFcin)的主要來源。由于天然的牛乳鐵蛋白及其多肽來源有限、成本較

2、高，因此通過基因工程的方法，利用大腸桿菌細(xì)胞生產(chǎn)重組牛乳鐵蛋白多肽，既可以解決牛乳鐵蛋白多肽來源稀少，又可以降低成本、提高效率、創(chuàng)造很大的經(jīng)濟(jì)利益。 選用牛肝臟為原料提取細(xì)胞總DNA，以此為模板，根據(jù)GenBank中已發(fā)表的bLF基因的cDNA序列，設(shè)計(jì)合成特異引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增bLF外顯子2，構(gòu)成重組牛乳鐵蛋白氨基末端多肽(rbLF-N)編碼基因。經(jīng)DNA序列分析證明與GenBank中cDNA序列162bp完全一致。通過Eco

3、RⅠ和BamHⅠ雙酶酶切，將rbLF-N重組基因插入到大腸桿菌(E.coli)表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T1中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T1/rbLF-N，并轉(zhuǎn)化E.coliBL21大腸桿菌菌株，經(jīng)抗性篩選、IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，獲得重組牛乳鐵蛋白氨基末端多肽-GST融合蛋白重組大腸桿菌轉(zhuǎn)化子BL21/rbLF-N，成功獲得表達(dá)的重組菌株，其rbLF-N-GST融合蛋白表達(dá)量達(dá)到20.4％，產(chǎn)率為1.68g/L。重組菌株表達(dá)的融合蛋白以包含體

4、存在，經(jīng)過復(fù)性研究，確定了最佳的復(fù)性條件是：pH值為8.5，蛋白溶液濃度為100μg/mL和DTT濃度為24mmol/L時(shí)，包含體rbLF-N-GST融合蛋白的復(fù)性率最高。復(fù)性后通過親和層析柱分離純化，并經(jīng)凝血酶酶解去除GST標(biāo)簽，獲得rbLF-N，經(jīng)HPLC分析，其純度達(dá)到93.23％，重組多肽氨基酸序列通過LC-MSMS二級(jí)質(zhì)譜鑒定。 rbLF-N經(jīng)胃蛋白酶酶解后，用于G+菌和G-菌的抗菌活性檢測(cè)，證明具有抗菌活性，抗菌效果

5、比文獻(xiàn)報(bào)道的化學(xué)合成的牛乳鐵蛋白肽的活性高。對(duì)病原菌S.Aureus，S.mutans，E.coli和K.pneumoniae的MIC和MBC分別為1.85，1.85，1.85，3.70μmol/L和3.73，1.85，1.85，7.40μmol/L。表明采用重組表達(dá)的牛乳鐵蛋白N端多肽rbLF-N經(jīng)胃蛋白酶酶解后，表現(xiàn)出天然的bLFcin生物活性。將獲得的具有生物活性的抗菌肽用于生豬肉的抗菌保鮮試驗(yàn)，以Nisin、乳酸為參照，試驗(yàn)結(jié)果